本文關(guān)鍵詞：香菇C91-3菌LP1-PI3K樣蛋白的克隆表達(dá)、分離純化及其活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 構(gòu)建高效快速且方便的His標(biāo)簽原核表達(dá)體系，對香菇C91-3菌自噬相關(guān)基因LP1-PI3K (Latcripin-1-PI3K)進(jìn)行克隆，將成功克隆的質(zhì)粒pET-32a-PI3K在E.coliRosetta-gami(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對該LP1-PI3K樣蛋白進(jìn)行分離、純化和復(fù)性。將純化復(fù)性后的目的蛋白作用于人肺癌A549細(xì)胞，通過對其生物學(xué)活性的檢測，初步分析其作用于腫瘤細(xì)胞的途徑和機(jī)制，為LP1-PI3K樣蛋白更進(jìn)一步的生物學(xué)功能與作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步深入揭示香菇C91-3菌的抗腫瘤機(jī)制及生物抗腫瘤藥物的研究提供依據(jù)。 方法： 1.根據(jù)GenBank: JQ327159.1中香菇C91-3菌相關(guān)蛋白LP1(Latcripin-1)的基因序列，分別設(shè)計特異性上下游引物，采用PCR方法，以LP1基因序列為模板，擴(kuò)增出LP1-PI3K基因結(jié)構(gòu)域序列。將LP1-PI3K基因克隆到pMD19-T SimpleVector克隆載體中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選出陽性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及PCR驗證后，進(jìn)行基因測序。再將純化回收后的LP1-PI3K基因克隆到pET-32a原核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)化入E.coli Rosetta-gami(DE3)，提取質(zhì)粒，進(jìn)一步經(jīng)雙酶切和特異引物PCR進(jìn)行驗證后，測序鑒定重組質(zhì)粒。 2.將鑒定正確的含目的基因的原核表達(dá)載體在E.coli Rosetta-gami(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。12%SDS-PAGE電泳鑒定蛋白的表達(dá)情況，并且用Western-blot進(jìn)行驗證。采用親和層析的方法分離純化LP1-PI3K樣蛋白，并對該蛋白進(jìn)行尿素梯度復(fù)性，最后測定純化后LP1-PI3K樣蛋白濃度。 3.將已鑒定的各濃度的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白作用于人肺癌A549細(xì)胞。用MTT(Methyl Thiazoly Ltetrazolium assay，MTT)法測定LP1-PI3K樣蛋白對腫瘤細(xì)胞的抑制率；用流式細(xì)胞儀檢測LP1-PI3K樣蛋白對人肺癌A549細(xì)胞的凋亡作用及對人肺癌A549細(xì)胞周期的影響；用電鏡法觀察LP1-PI3K樣蛋白作用于人肺癌A549腫瘤細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；用Western-blot檢測自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3（微管相關(guān)蛋白1輕鏈3），根據(jù)LC3-I和LC3-II表達(dá)的變化，分析LP1-PI3K樣蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的水平。 結(jié)果： 1. PCR擴(kuò)增出大小為747bp的基因片段，測序比對結(jié)果顯示與GenBank上LP1基因序列中PI3K樣結(jié)構(gòu)域序列的同源性為100%，并成功構(gòu)建了pET-32a原核表達(dá)載體。 2.此結(jié)構(gòu)域蛋白在E.coli Rosetta-gami(DE3)中被大量誘導(dǎo)表達(dá)，12%SDS-PAGE電泳顯示，蛋白分子質(zhì)量大約為44KDa(計算載體標(biāo)簽后的蛋白相對分子量)。誘導(dǎo)表達(dá)過程中，目的蛋白在加入誘導(dǎo)劑后開始表達(dá)，3小時效率最高。Western-blot結(jié)果顯示E.coli Rosetta-gami(DE3)所表達(dá)的蛋白為LP1-PI3K樣蛋白。通過組氨酸標(biāo)簽親和層析分離和純化該蛋白，12%SDS-PAGE顯示得到純化的LP1-PI3K樣蛋白。 3.對LP1-PI3K樣蛋白生物學(xué)活性的初步檢測：①對于人肺癌A549細(xì)胞，LP1-PI3K樣蛋白作用濃度為分別為15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml，作用時間分別為24小時、48小時、72小時。當(dāng)濃度為15μg/ml時抑瘤率分別為3.10%，8.22%，15.33%；當(dāng)濃度為30μg/ml時抑瘤率分別為7.85%，14.36%，，19.70%；當(dāng)濃度為60μg/ml時抑瘤率分別14.15%，29.49%，31.48%。MTT法檢測結(jié)果：隨著作用時間的延長和濃度的增加，抑瘤率逐漸增加。除15μg/ml的LP1-PI3K樣蛋白作用24小時與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組與對照組相比有顯著性差異(P㩳0.05)。MTT實(shí)驗結(jié)果說明LP1-PI3K樣蛋白對人肺癌A549細(xì)胞有顯著地抑制作用。②流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，LP1-PI3K樣蛋白具有一定誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡的能力，其作用可能與自噬相關(guān)。終濃度為30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml的此蛋白作用于人肺癌A549細(xì)胞48小時后，最大早期細(xì)胞凋亡率為8.49%，18.58%，20.45%；最大晚期細(xì)胞凋亡率為5.01%，10.06%，14.88%。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗組人肺癌A549細(xì)胞，在LP1-PI3K樣蛋白作用下各期細(xì)胞較空白對照組相比S期變化不大，G1期G2/M期雖有變化，但該變化沒有呈現(xiàn)出規(guī)律性。此外在G1期峰前還出現(xiàn)凋亡峰，但該凋亡峰沒有表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。③透射電子顯微鏡顯示，60μg/ml LP1-PI3K樣蛋白作用于人肺癌A549細(xì)胞48小時后，其形態(tài)學(xué)發(fā)生很大改變。對照組人肺癌A549細(xì)胞，膜相結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，線粒體豐富；目的蛋白作用組細(xì)胞：核染色質(zhì)固縮，核碎裂，胞漿內(nèi)空泡增多，出現(xiàn)凋亡小體，尤其在較大范圍細(xì)胞中出現(xiàn)了大量的自噬小體，自噬體的出現(xiàn)是LP1-PI3K樣蛋白作用于人肺癌A549的特征現(xiàn)象。④Western-blot檢測LC3。在對照組中兩種LC3自噬標(biāo)記物：LC3-I和LC3-II的數(shù)量均較低。而將LP1-PI3K樣蛋白60μg/ml作用于人肺癌A549細(xì)胞48小時后，從Western-blot的結(jié)果分析LC3-I和LC3-II的表達(dá)量均高于空白對照組，且LC3-II的表達(dá)明顯高于LC3-I，說明LP1-PI3K樣蛋白能誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞自噬體的產(chǎn)生。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗成功獲得了LP1-PI3K樣結(jié)構(gòu)域序列，并成功構(gòu)建了pET-32a原核表達(dá)體系。 2.本實(shí)驗成功在E.coli Rosetta-gami(DE3)宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)出LP1-PI3K樣蛋白；該蛋白經(jīng)組氨酸標(biāo)簽親和層析柱成功純化；尿素梯度復(fù)性成功。 3. LP1-PI3K樣蛋白生物學(xué)功能經(jīng)初步研究，其可抑制肺癌A549細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡，同時可誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞自噬。LP1-PI3K樣蛋白可初步歸類為III型PI3K，其誘導(dǎo)的凋亡、自噬及其相互之間的作用機(jī)制有待深入研究。
【關(guān)鍵詞】：香菇C91-3菌 Latcripin-1蛋白 自噬 PI3K結(jié)構(gòu)域 LC3
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-16
• 第一部分 香菇 C91-3 菌 LP1-PI3K 樣結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)載體的構(gòu)建及序列分析16-26
• 1. 材料16-17
• 1.1 質(zhì)粒與菌株16
• 1.2 主要儀器及試劑16-17
• 1.3 實(shí)驗所需引物17
• 2. 方法17-20
• 2.1 LP1-PI3K 基因的獲得17-18
• 2.2 引物設(shè)計和 PCR 擴(kuò)增特異性基因片段18
• 2.3 克隆載體 pMD19-T-LP1-PI3K 的構(gòu)建及篩選18-19
• 2.4 表達(dá)載體 pET-32a-LP1-PI3K 的構(gòu)建及篩選19-20
• 2.5 LP1-PI3K 樣蛋白結(jié)構(gòu)分析20
• 3. 結(jié)果20-26
• 3.1 LP1-PI3K 基因的獲得20-21
• 3.2 克隆載體 pMD19-T-LP1-PI3K 的構(gòu)建及鑒定21-22
• 3.3 表達(dá)載體 pET-32a-LP1-PI3K 的構(gòu)建及鑒定22-24
• 3.4 LP1-PI3K 樣蛋白結(jié)構(gòu)分析24-26
• 第二部分 香菇 C91-3 菌 LP1-PI3K 樣蛋白在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中的表達(dá)分離和純化26-32
• 1. 材料26-27
• 1.1 主要儀器26
• 1.2 主要試劑26-27
• 2. 方法27-30
• 2.1 LP1-PI3K 樣蛋白在 E.coli Rosetta-gami(DE3) 中的誘導(dǎo)表達(dá)27
• 2.2 Western-blot 分析27-28
• 2.3 LP1-PI3K 樣蛋白的純化28-29
• 2.4 LP1-PI3K 樣蛋白(包涵體)的尿素梯度復(fù)性29-30
• 3. 結(jié)果30-32
• 3.1 LP1-PI3K 樣蛋白在 E.coli Rosetta-gami(DE3) 中的誘導(dǎo)表達(dá)30
• 3.2 Western-blot 分析30-31
• 3.3 LP1-PI3K 樣蛋白純化后 SDS-PAGE 電泳結(jié)果及Western-blot 鑒定31-32
• 第三部分 香菇 C91-3 菌 LP1-PI3K 樣蛋白抗腫瘤活性及作用機(jī)制的初步研究32-42
• 1. 材料32-33
• 1.1 主要儀器32
• 1.2 主要試劑32
• 1.3 細(xì)胞株32-33
• 2. 方法33-35
• 2.1 人肺癌 A549 細(xì)胞的培養(yǎng)33
• 2.2 MTT 法測定 LP1-PI3K 樣蛋白的抑瘤率33
• 2.3 流式細(xì)胞儀測定 LP1-PI3K 樣蛋白對腫瘤細(xì)胞的影響33-34
• 2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)34
• 2.5 Western-blot 分析 LC3 表達(dá)34-35
• 3. 結(jié)果35-42
• 3.1 MTT 法測定 LP1-PI3K 樣蛋白的對細(xì)胞的抑制率35-36
• 3.2 流式細(xì)胞儀測定 LP1-PI3K 樣蛋白對腫瘤細(xì)胞的影響36-39
• 3.3 透射電鏡觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)39-41
• 3.4 Western-blot 分析 LC3 表達(dá)41-42
• 討論42-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 綜述49-63
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 附錄63-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況64-65
• 致謝65-66

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 劉奔;鐘民濤;王曉麗;孫文長;李星云;劉磊;張偉;黃敏;;香菇菌C91-3凋亡相關(guān)蛋白24414對人肺癌細(xì)胞A549凋亡作用及其機(jī)制的研究[J];中華腫瘤防治雜志;2012年06期

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  本文關(guān)鍵詞：香菇C91-3菌LP1-PI3K樣蛋白的克隆表達(dá)、分離純化及其活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：403656