研究輪狀病毒(Rotavirus,RV)非結(jié)構(gòu)蛋白5(NSP5)在體外對RV復(fù)制的作用。以質(zhì)粒pEGFP-N2為載體構(gòu)建出可特異性表達重組蛋白NSP5的真核表達載體后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MA104細胞并分別通過免疫熒光和Western Blot檢測NSP5在轉(zhuǎn)染后不同時間的表達差異。隨后,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及對照組細胞分別接種相同劑量的RV,一定時間后根據(jù)GFP分布來確認重組蛋白NSP5在細胞內(nèi)的遷移變化情況,并比較實驗組和對照組之間的RV復(fù)制能力差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NSP5蛋白在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48 h后表達達到頂峰。此外,GFP也顯示NSP5蛋白隨RV的感染從彌散狀轉(zhuǎn)變?yōu)辄c狀聚集,且轉(zhuǎn)染該重組質(zhì)粒的細胞內(nèi)RV復(fù)制水平明顯高于對照細胞。說明了輪狀病毒NSP5對病毒的復(fù)制具有明顯促進作用,這也為深入了解RV的感染、復(fù)制及致病機理提供理論基礎(chǔ)。

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【部分圖文】：

圖1pEGFP-N2-NSP5重組質(zhì)粒構(gòu)建流程

挑取培養(yǎng)板中長勢良好的單克隆菌落至中管(Kana:50μg/mL)擴大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒,并對其進行雙酶切、PCR及測序鑒定。特異表達重組蛋白NSP5的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-N2-NSP5,構(gòu)建過程如圖1。1.2.4pEGFP-N2-NSP5的真核細胞轉(zhuǎn)染及其表達水平檢測

圖2重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定的電泳結(jié)果

重組質(zhì)粒pEGFP-N2-NSP5轉(zhuǎn)染MA104細胞后,分別于轉(zhuǎn)染24、36、48和72h后取出細胞做免疫熒光,并于倒置熒光顯微鏡下觀察特異性標記紅色熒光的重組蛋白NSP5在細胞內(nèi)的分布及表達量與時間的關(guān)系。結(jié)果顯示,重組蛋白NSP5在MA104細胞的胞質(zhì)和胞核中均有分布且主要....

圖3免疫熒光和WesternBlot鑒定pEGFP-N2-NSP5的NSP5蛋白表達

圖2重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定的電泳結(jié)果2.3瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-NSP5對RV復(fù)制的影響

圖4pEGFP-N2-NSP5對RV復(fù)制影響的檢測結(jié)果

以RV標準毒株One-StepProbeqRT-PCR的Cq值為Y軸、標準毒株濃度以10為底的對數(shù)為X軸建立標準曲線(圖4-a):Y=-4.8205x+49.434,R2=0.9922。將RV樣品Cq值帶入標曲后可求出對應(yīng)的RV拷貝濃度。3組不同處理的MA104細胞接種等量R....

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