本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌鐵載體pyoverdine在周質(zhì)空間合成途徑中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：銅綠假單胞菌是一種條件致病菌,能夠在醫(yī)院中引起10%-20%的感染,一旦感染,普通的抗生素很難根除,而且死亡率很高,因此,預防銅綠假單胞菌感染,是非常重要的。銅綠假單胞菌一個重要的致病因素就是一種能夠螯合鐵的小分子物質(zhì)-鐵載體。 一直以來,鐵載體作為微生物獲得鐵的主要方式,它的合成和轉(zhuǎn)運機制研究具有重要理論意義與實際應用價值。在銅綠假單胞菌中有兩種比較重要的鐵載體,一種為pyochelin螯鐵蛋白,另一種為pyoverdine(PVD)水溶性熒光素鐵載體。由于所有類型的PVD都具有同樣的高度保守的熒光基團,上述蛋白在各種熒光假單胞菌中也是高度保守的,因此我們期望通過X射線晶體學的方法來解析合成PVD的一系列酶分子結(jié)構(gòu),為抗銅綠假單胞菌的高效、專一性藥物的設(shè)計提供新的靶點。 銅綠假單胞菌PAO1的PVDI是pyoverdine研究的原型,己發(fā)現(xiàn)十幾種基因參與其合成。在本論文是以與PVDI成熟過程中相關(guān)的蛋白質(zhì)為研究對象的。PVD的成熟過程如下：在細胞質(zhì)中,在NRPS催化下ferribactin前體合成,ferribactin同時攜帶不成熟的發(fā)色團(chromophore),在PvdE作用下轉(zhuǎn)運到周質(zhì)空間,在PvdN、O、P、Q以及其它未知蛋白作用下,完成PVDI的合成,此時PVDI具有熒光基團,即合成了成熟的chromophore,在未知轉(zhuǎn)運蛋白作用下轉(zhuǎn)運到細胞外。 為了闡明PvdN、PvdO以及PvdP在PVD成熟途徑中的作用,本文使用分子生物學的方法克隆表達和純化了PvdO以及PvdN的native蛋白質(zhì)和硒代蛋白質(zhì),并進行了晶體生長和優(yōu)化,得到良好的單晶,在SSRF收集并處理了數(shù)據(jù),用CCP4, COOT, Phenix及CNS等結(jié)構(gòu)生物學軟件解析了PvdO以及PvdN的結(jié)構(gòu)。通過分子生物學的方法也克隆表達和純化了PvdP的蛋白質(zhì),并進行了晶體的生長和優(yōu)化,也得到了晶型比較好的單晶,但是不能夠拿到晶體的數(shù)據(jù)。通過對PvdO以及PvdN的結(jié)構(gòu)分析,設(shè)計了相對應的功能實驗,期望能夠獲得PvdO以及PvdN的催化機制。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 鐵載體PVD 結(jié)構(gòu) 催化機制
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378.991
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 符號說明10-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 鐵載體11-12
• 1.1.1 鐵載體定義11-12
• 1.1.2 鐵載體合成途徑12
• 1.1.3 鐵載體重要功能12
• 1.2 銅綠假單胞菌12-17
• 1.2.1 銅綠假單胞菌生物學特性12-13
• 1.2.2 銅綠假單胞菌的鐵載體13-14
• 1.2.3 銅綠假單胞菌對人類的威脅14
• 1.2.4 PvdI的合成途徑14-17
• 1.3 本文的主要內(nèi)容、目的、意義及創(chuàng)新點17-23
• 1.3.1 蛋白質(zhì)生物學分析17-20
• 1.3.2 研究內(nèi)容20
• 1.3.3 目的、意義20-21
• 1.3.4 創(chuàng)新21-23
• 第二章 蛋白的表達、純化與結(jié)晶23-59
• 2.1 實驗材料23-28
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒23
• 2.1.2 試劑和工具酶23-24
• 2.1.3 常規(guī)儀器24
• 2.1.4 試劑24-28
• 2.2 實驗方法28-38
• 2.2.1 PvdO表達載體的構(gòu)建28-33
• 2.2.2 PvdN表達載體的構(gòu)建33-34
• 2.2.3 PvdP表達載體的構(gòu)建34-35
• 2.2.4 蛋白的表達與純化35-38
• 2.3 實驗結(jié)果38-50
• 2.3.1 PvdO的分離純化38-43
• 2.3.2 PvdP的分離純化43-46
• 2.3.3 PvdN的分離純化46-50
• 2.4 蛋白質(zhì)晶體的篩選、優(yōu)化50-56
• 2.4.1 引言50
• 2.4.2 實驗材料50-51
• 2.4.3 蛋白質(zhì)的結(jié)晶51-53
• 2.4.4 PvdO的晶體53-55
• 2.4.5 PvdP的晶體55
• 2.4.6 PvdN的晶體55-56
• 2.5 本章小結(jié)56-59
• 第三章 解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)59-73
• 3.1 收集與處理衍射數(shù)據(jù)59
• 3.1.1 X射線的產(chǎn)生59
• 3.1.2 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的基本原理59
• 3.2 收集與處理衍射數(shù)據(jù)59-63
• 3.2.1 測試晶體衍射數(shù)據(jù)59-60
• 3.2.2 在SSRF上收集數(shù)據(jù)60
• 3.2.3 晶體的快速冷凍60
• 3.2.4 處理衍射數(shù)據(jù)60-62
• 3.2.5 數(shù)據(jù)處理的結(jié)果62-63
• 3.3 相位的確定63-67
• 3.3.1 相位問題63
• 3.3.2 相位確定的方法63-66
• 3.3.3 實驗結(jié)果66-67
• 3.4 電子密度圖的解析與模型構(gòu)建67-68
• 3.4.1 電子密度圖67-68
• 3.4.2 建立結(jié)構(gòu)模型68
• 3.5 修正結(jié)構(gòu)模型68-73
• 3.5.1 結(jié)構(gòu)修正的原理68-69
• 3.5.2 修正結(jié)構(gòu)的一般方法69-70
• 3.5.3 結(jié)構(gòu)修正的結(jié)果70-73
• 第四章 PvdO與PvdN結(jié)構(gòu)與功能的研究73-85
• 4.1 實驗的理論技術(shù)和方法73-79
• 4.1.1 動態(tài)光散射(DLS)73-75
• 4.1.2 等溫滴定量熱法(ITC)75-76
• 4.1.3 差示掃描量熱法(DSC)76-79
• 4.2 晶體結(jié)構(gòu)與功能描述79-83
• 4.2.1 PvdO晶體結(jié)構(gòu)與功能79-82
• 4.2.2 PvdN晶體結(jié)構(gòu)與功能82-83
• 4.3 本章總結(jié)83-85
• 全文總結(jié)和討論85-87
• 參考文獻87-95
• 致謝95-96
• 學位論文評閱及答辯情況表96

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 梁建根;郝中娜;王連平;陶榮祥;鄭經(jīng)武;;嗜鐵素功能研究概述[J];中國農(nóng)學通報;2011年05期

  本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌鐵載體pyoverdine在周質(zhì)空間合成途徑中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：397887