發(fā)布時(shí)間：2017-05-24 21:02

  本文關(guān)鍵詞：低密度瘧原蟲血癥檢測(cè)方法的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究針對(duì)我國消除瘧疾階段流行程度較低,存在一定比例的低原蟲密度的瘧疾病例,以至鏡檢難以發(fā)現(xiàn)潛在傳染源這一主要問題,圍繞低密度瘧原蟲血癥的定量界定、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的比較以及現(xiàn)場(chǎng)樣本的檢測(cè),通過對(duì)以PCR為基礎(chǔ)的三種分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)比較研究,以探討適合低密度瘧原蟲血癥患者的較為靈敏檢測(cè)方法,在此基礎(chǔ)上了解瘧疾癥狀人群中低密度瘧原蟲血癥患者的程度和比例,為我國消除瘧疾傳染源發(fā)現(xiàn)與管理以及診斷參比實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)建設(shè)充實(shí)技術(shù)方法與理論依據(jù),具有一定的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。 方法研究分兩大部分,分別為：低密度瘧原蟲血癥實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法比較和低密度瘧原蟲血癥現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)與驗(yàn)證。第一部分采用惡性瘧原蟲(FCCI/HN)體外培養(yǎng)及同步化、顯微鏡及三種常用分子生物學(xué)技術(shù),對(duì)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的同步化的惡性瘧原蟲血和現(xiàn)場(chǎng)采集的間日瘧原蟲血進(jìn)行了稀釋和梯度檢測(cè),以鏡檢技術(shù)無法檢出的稀釋梯度上的原蟲密度為臨界值界定低密度瘧原蟲血癥。對(duì)上述低密度惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲血樣進(jìn)一步梯度稀釋,采用多重PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)PCR三種分子生物學(xué)方法對(duì)不同稀釋梯度的血樣逐一檢測(cè),比較不同方法的檢測(cè)限及檢出率。第二部分在實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上運(yùn)用三種PCR方法同時(shí)對(duì)現(xiàn)場(chǎng)采集的147份鏡檢陰性但具有發(fā)熱癥狀的瘧疾疑似病例樣本進(jìn)行檢測(cè),以進(jìn)一步現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)證三種方法的檢測(cè)敏感性,并評(píng)價(jià)研究現(xiàn)場(chǎng)低密度瘧原蟲血癥的比例。(1)通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)及同步化處理獲取一定濃度的環(huán)狀體期占99%以上的惡性瘧原蟲血1份,通過現(xiàn)場(chǎng)采集的方式獲取間日瘧原蟲外周血樣本1份,并分別涂制血膜,其中厚血膜用血量約4～4.5μl,薄血膜用血量1～1.5μl,利用吉氏染色法進(jìn)行染色,由2名有經(jīng)驗(yàn)的瘧原蟲鏡檢專家(經(jīng)WHO認(rèn)證Ⅲ級(jí)以上專家)進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)并計(jì)數(shù)原蟲密度,其中對(duì)來自實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的惡性瘧原蟲血按紅細(xì)胞數(shù)為4.5×106個(gè)/μl血采用薄血膜計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)；對(duì)來自現(xiàn)場(chǎng)的間日瘧原蟲血樣本則采用白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)原蟲密度,其中白細(xì)胞的計(jì)數(shù)以實(shí)際計(jì)數(shù)為準(zhǔn)(本樣本為3.2×103個(gè)白細(xì)胞/μl血)。(2)利用健康O型血對(duì)上述濃度已知的間日瘧原蟲血樣和惡性瘧原蟲血樣按照1：40、1：80、1：160、......1：40960等11個(gè)濃度梯度進(jìn)行倍比稀釋,每一濃度分三組每組3張血片進(jìn)行涂片鏡檢,由2名有經(jīng)驗(yàn)的瘧原蟲鏡檢專家進(jìn)行檢測(cè),確定每一濃度所有血的顯微鏡檢測(cè)結(jié)果,整張厚血膜未發(fā)現(xiàn)瘧原蟲者記為陰性。當(dāng)某一濃度3張血片都為陰性時(shí),該濃度的上一濃度即為低密度瘧原蟲血癥的臨界濃度(即顯微鏡檢測(cè)限)本研究將濃度低于該值的瘧原蟲血樣定為低密度瘧原蟲血樣；(3)對(duì)顯微鏡檢測(cè)確定的低密度瘧原蟲血樣按照(1：2、1：22、1：23、1：24、1：25......)進(jìn)行倍比稀釋并利QIAamp DNA mini kit提取DNA,同時(shí)利用三種常用的分子生物學(xué)方法(多重PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)PCR)對(duì)每一濃度梯度樣本進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)三者的檢測(cè)限和不同濃度的檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,檢測(cè)限低、各濃度檢出率高的檢測(cè)方法即為本研究的適合低密度瘧原蟲血癥檢測(cè)的方法；(4)利用QIAamp DNA mini kit提取現(xiàn)場(chǎng)采集的147份具有發(fā)熱癥狀但通過顯微鏡檢測(cè)結(jié)果為陰性的瘧疾疑似病例的濾紙血樣本DNA,并同時(shí)利用上述三種分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè),統(tǒng)計(jì)各種分子生物學(xué)方法的檢出率,利用χ2檢驗(yàn)對(duì)三種方法的檢測(cè)率進(jìn)行比較分析,從而對(duì)三種方法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和驗(yàn)證。 結(jié)果(1)對(duì)于惡性瘧原蟲：顯微鏡檢測(cè)的臨界值為21.92個(gè)蟲/μl血,多重PCR、巢式PCR和實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)限分別為0.1713個(gè)蟲/μl血、0.0856個(gè)蟲/μl血、0.1713個(gè)蟲/μl血。當(dāng)原蟲密度為0.1713個(gè)蟲/μl血時(shí),三種方法檢出率分別為66.7%(6/9)、100%(9/9)、100%(9/9),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；當(dāng)原蟲密度為0.0856個(gè)蟲/μl血時(shí),三種方法檢出率分別為0%(0/9)、66.7%(6/9)、55.6%(5/9),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；當(dāng)原蟲密度為0.0428個(gè)蟲/μl血時(shí),三種方法檢出率分別為0%(0/9)、33.3%(3/9)、44.4%(4/9),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；當(dāng)原蟲密度為0.0214個(gè)蟲/μl血時(shí),三種方法檢出率分別為0%(0/9)、11.1%(1/9)、11.1%(1/9),差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；當(dāng)原蟲密度為0.0107個(gè)蟲/μl血時(shí),三種方法均未能檢出,檢出率均為0%(0/9)。(2)對(duì)于間日瘧原蟲：顯微鏡檢測(cè)的臨界值為11.06個(gè)蟲/μl血,多重PCR、巢式PCR和實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)限分別為0.3455個(gè)蟲/μl血、0.0864個(gè)蟲/μl血和0.3455個(gè)蟲/μl血。當(dāng)原蟲密度為0.1728個(gè)蟲/μl血時(shí),三種方法檢出率分別為0%(0/9)、100%(9/9)、11.1%(1/9),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；當(dāng)原蟲密度為0.0864個(gè)蟲/μ1血時(shí),三種方法檢出率分別為11.1%(1/9)、77.8%(7/9)、100%(9/9),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；當(dāng)原蟲密度為0.0432個(gè)蟲/μl血時(shí),三種方法檢出率分別為0%(0/9)、66.7%(6/9)、0%(0/9),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；當(dāng)原蟲密度為0.0216個(gè)蟲/μl血時(shí),三種方法檢出率分別為0%(0/9)、11.1%(1/9)、0%(0/9),差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)對(duì)現(xiàn)場(chǎng)采集的147份鏡檢陰性的瘧疾疑似病例血樣中,三種方法分別檢出陽性：3例、13例、8例。檢出率分別為2.0%(3/147)、8.8%(13/147)、5.4%(8/147),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。巢式PCR檢測(cè)結(jié)果顯示低密度瘧原蟲血癥患者在顯微鏡鏡檢陰性的瘧疾疑似病例中所占比例為8.8%(13/147),由此推斷我國云南省騰沖縣低密度瘧原蟲血癥患者的比例約為：8.8%,95%CI為(4.2%,13.4%)。 結(jié)論結(jié)果表明：鏡檢技術(shù)對(duì)惡性瘧原蟲的檢測(cè)限為21.96個(gè)蟲/μl血,間日瘧原蟲為11.05個(gè)蟲/μl血,以此臨界值界定低密度瘧原蟲血癥。三種PCR檢測(cè)技術(shù)均能一定程度地檢測(cè)低密度瘧原蟲血癥血樣,其中巢式PCR方法檢測(cè)限最低(對(duì)惡性瘧原蟲血達(dá)0.0856個(gè)蟲/μl血,對(duì)間日瘧原蟲達(dá)0.0864個(gè)蟲/μl血),不同濃度下,檢出率較多重PCR和實(shí)時(shí)PCR高。其靈敏度明顯高于其它兩種方法�，F(xiàn)場(chǎng)采集的147份鏡檢陰性但具發(fā)熱癥狀(設(shè)定為低密度瘧原蟲血癥患者)血樣檢測(cè)結(jié)果也顯示巢式PCR的檢出率最高,檢出13例,表明研究現(xiàn)場(chǎng)低密度瘧原蟲血癥患者高達(dá)8.8%(4.2%,13.4%)。
【關(guān)鍵詞】：低密度瘧原蟲血癥 PCR方法 檢測(cè)限 檢出率
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R531.3;R3416
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-17
• 研究背景及據(jù)11-15
• 研究目的15
• 研究內(nèi)容15-16
• 技術(shù)路線16-17
• 第一部分 低密度瘧原蟲血癥實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的比較17-41
• 前言17
• 材料和方法17-28
• 結(jié)果28-38
• 討論38-41
• 第二部分 低密度瘧原蟲血癥現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)與驗(yàn)證41-45
• 前言41
• 材料與方法41-43
• 結(jié)果43
• 討論43-45
• 全文小結(jié)45-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 附錄52-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：低密度瘧原蟲血癥檢測(cè)方法的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：391937