目的利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立miRNA敲除小鼠模型。方法根據(jù)miRNA基因序列,設(shè)計(jì)針對(duì)miR-301a的gRNA引物序列(雙靶點(diǎn)),PCR擴(kuò)增獲得針對(duì)miR-301a的體外轉(zhuǎn)錄模板DNA和構(gòu)建Cas9體外轉(zhuǎn)錄模板,然后進(jìn)行Cas9和gRNA體外轉(zhuǎn)錄。利用體外轉(zhuǎn)錄的gRNA/Cas9mRNA對(duì)小鼠受精卵顯微注射,并利用T7E1酶切和基因測(cè)序?qū)iR-301a突變進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。結(jié)果 PCR擴(kuò)增、凝膠電泳和基因測(cè)序鑒定證實(shí),獲得序列正確的用于體外轉(zhuǎn)錄的模板DNA;體外轉(zhuǎn)錄獲得gRNA/Cas9mRNA,順利完成對(duì)小鼠受精卵的顯微注射;利用T7E1酶切對(duì)miR-301a突變進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)8只新生小鼠中有7只(87.5%)被鑒定在miR-301a位點(diǎn)攜帶突變;基因測(cè)序結(jié)果顯示,各小鼠均有不同程度的堿基插入或缺失突變,其中缺失堿基數(shù)目最多的4號(hào)小鼠產(chǎn)生31個(gè)堿基缺失。結(jié)論成功建立miR-301a基因高效敲除小鼠模型。

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【文章目錄】：
1　材料和方法
2　結(jié)　果
3　討　論
4　利益沖突



本文編號(hào)：3854471