本文關(guān)鍵詞：Ad5-GFP的大規(guī)模擴(kuò)增、純化及生物活性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：通過實(shí)驗(yàn)摸索腺病毒大規(guī)模擴(kuò)增的條件、細(xì)胞破碎的最優(yōu)方法、硫酸銨沉淀的最適濃度、疏水柱及離子交換柱聯(lián)用純化腺病毒的最佳工藝、腺病毒最佳的保存條件、最后通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究純化后的腺病毒活性。 方法：以腺病毒的滴度、純度和回收率來考察最后的結(jié)果。 一、比較不同MOI值、感染時間下腺病毒的滴度，用于確定大規(guī)模擴(kuò)增的最佳條件。 二、比較反復(fù)凍融法、超聲波法和高壓滲透壓法后腺病毒的滴度，確定細(xì)胞破碎的最佳方法。 三、配置不同百分比的飽和硫酸銨來沉淀腺病毒，比較回收率后確定最適合的飽和硫酸銨濃度。 四、比較不同疏水柱類型和鹽濃度、陰離子交換柱的類型，通過腺病毒的滴度、純度和回收率來確定最適合的工藝條件。 五、采用正交設(shè)計的實(shí)驗(yàn)的方法確定腺病毒的最適合保存條件。 六、通過ELISA法比較純化前后腺病毒在體內(nèi)體外綠色熒光蛋白的表達(dá)量，以及蛋白的表達(dá)量隨腺病毒感染的滴度、時間的變化。 本實(shí)驗(yàn)參考了相關(guān)文獻(xiàn)后，設(shè)計了用硫酸銨沉淀法將腺病毒上清中的腺病毒濃縮粗純，不經(jīng)過處理直接上疏水柱，再過離子交換柱的辦法來純化腺病毒，最后通過體內(nèi)體外比較純化前后的蛋白表達(dá)量。 結(jié)果： 一、腺病毒大規(guī)模擴(kuò)增的最佳條件為：MOI值為10、感染時間為24小時，收獲的腺病毒滴度最高。 二、比較反復(fù)凍融法、超聲波法和高壓滲透壓法發(fā)現(xiàn)超聲波法破碎細(xì)胞的效果最好，破損率等達(dá)到96%。 三、通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硫酸銨沉淀法最適合濃度為60%的飽和硫酸銨，回收率能達(dá)到70%。 四、使用美國GE Healthcare公司的Sepharose High Performance柱，在平衡緩沖液A液：2.5M（NH4）2SO4，40mM Tris-Hcl(pH8.0)、5%甘油、1mM MgCl2；洗脫緩沖液B液：40mM Tris-Hcl(pH8.0)、5%甘油、1mM MgCl2下梯度洗脫20個柱體積，腺病毒回收率為79.6%。 五、使用陰離子交換柱Q xl，，在平衡平衡緩沖液A液：40mM Tris-Hcl(pH=8.0)、5%甘油、1mM MgCl2；平衡緩沖液B液：1M NaCl，40mM Tris-Hcl(pH=8.0)、5%甘油、1mM MgCl2下，梯度洗脫20個柱體積，腺病毒回收率為92.3%。最后的總回收率達(dá)到53.7%，純度為91.0%。 六、腺病毒的最適合保存條件為；-80度、5%甘油、1mM MgCl2。 七、純化后的腺病毒表達(dá)的的綠色熒光蛋白的表達(dá)量要高于純化前的。 結(jié)論：通過腺病毒硫酸銨沉淀、過疏水柱再過離子交換柱的辦法來純化腺病毒的辦法得到的腺病毒沉淀與傳統(tǒng)的CsCl密度梯度離心法類似、但回收率高于后者。因此本方法好于傳統(tǒng)的CsCl密度梯度離心法。同時通過實(shí)驗(yàn)證明純化后的腺病毒活性要好于純化前。本實(shí)驗(yàn)提供一種腺病毒擴(kuò)增及純化的方法，及腺病毒保存及注射的最佳條件，可以給其他腺病毒基因藥物的方面的研究提供借鑒。
【關(guān)鍵詞】：腺病毒 大規(guī)模擴(kuò)增 純化 純度 回收率
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R346
【目錄】：

• 目錄4-6
• 縮略語6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 第一章 腺病毒大規(guī)模擴(kuò)增及層析前處理研究14-34
• 1.1 引言14-17
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 1.2.1 試劑17-18
• 1.2.2 儀器18-19
• 1.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑的配制19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法19-27
• 1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇19
• 1.3.2 細(xì)胞傳代19-20
• 1.3.3 十層板大規(guī)模培養(yǎng) 293 細(xì)胞20-21
• 1.3.4 不同 MOI 值的腺病毒感染 293 細(xì)胞后滴度的比較21
• 1.3.5 腺病毒感染 293 細(xì)胞不同時間后滴度的比較21
• 1.3.6 細(xì)胞破碎方法的研究21-22
• 1.3.7 病毒上清硫酸銨沉淀濃度摸索22-23
• 1.3.8 病毒釋放量指標(biāo)的檢測23-27
• 1.4 結(jié)果27-32
• 1.4.1 不同 MOI 值的腺病毒感染 HEK-293 細(xì)胞后滴度的比較27-28
• 1.4.2 腺病毒感染 293 細(xì)胞不同時間后滴度的比較28-30
• 1.4.3 不同破碎方法結(jié)果比較30-31
• 1.4.4 不同硫酸銨濃度沉淀腺病毒的上清結(jié)果比較31-32
• 1.5 小結(jié)32-34
• 第二章 層析工藝方法的優(yōu)化34-54
• 2.1 引言34-36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 2.2.1 試劑36
• 2.2.2 儀器36-37
• 2.2.3 試劑的配制37
• 2.3 腺病毒柱層析方法研究37-44
• 2.3.1 疏水柱層析工藝研究37-39
• 2.3.2 離子交換柱層析工藝研究39-40
• 2.3.3 腺病毒純度的檢測40-41
• 2.3.4 腺病毒回收率的檢測41
• 2.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計摸索腺病毒保存的最適合條件41-42
• 2.3.6 純化前后腺病毒感染 293 細(xì)胞后 GFP 的表達(dá)情況42-44
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-52
• 2.4.1 疏水填料的結(jié)果44-48
• 2.4.2 不同離子交換柱填料類型的結(jié)果48-50
• 2.4.3 最終純化后腺病毒 A260/A280 的結(jié)果50
• 2.4.4 最終純化后腺病毒 monQ 的結(jié)果50-51
• 2.4.5 不同配方保存腺病毒的結(jié)果51-52
• 2.5 小結(jié)52-54
• 實(shí)驗(yàn)討論54-57
• 參考文獻(xiàn)57-66
• 發(fā)表的論文66-67
• 致謝67

【相似文獻(xiàn)】

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