本文關(guān)鍵詞：不同亞型重組人白細胞介素8蛋白表達、純化與活性檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：白細胞介素一8 (Interleukin-8, IL-8)是一種多功能性的細胞因子,屬于趨化因子CXC亞家族的一員,是體內(nèi)炎癥反應(yīng)應(yīng)答的主要介質(zhì)之一。除常規(guī)生化檢測方法之外,尚未有報道利用蛋白質(zhì)片段互補檢測(Protein FragmentComplementation Assay, PCA)技術(shù)對IL-8的生物學活性進行測定。本文利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)重組人源性IL-8的高效表達、純化,并利用PCA技術(shù)實現(xiàn)重組IL-8活性檢測。方法：將3種不同亞型的重組人IL-8基因片段分別與表達載體pME-15-6His和pET-32a連接,轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞HEK 293F和大腸桿菌BL2l(DE3),進行IL-8的表達。采用IMAC親和層析柱對重組人IL-8進行純化。根據(jù)PCA技術(shù),構(gòu)建了Split-TEV GPCR激活檢測系統(tǒng),對純化的目的蛋白進行了細胞內(nèi)生物學活性檢測。結(jié)果：成功構(gòu)建了真核表達載體pME-15-6His/IL-8formI,前體IL-8基因在HEK293F中正確分泌表達,其N端信號肽(殘基1-20)被切除,經(jīng)過純化得到的重組蛋白為成熟的IL-8 form I(殘基21-99)；成功構(gòu)建了原核表達載體pET-32a/IL-8 formII和pET-32a/IL-8 form III,N端融合了Trx標簽的重組蛋白在大腸桿菌中正確表達,經(jīng)過純化和重組腸激酶酶切得到的重組蛋白為IL-8 form II(殘基23-99)和IL-8form III(殘基28-99)。純化后的重組人IL-8對其天然受體IL8RB具有明顯的激活活性,其ECso值分別為：12.32ng/ml (Form Ⅰ),15.14 ng/ml (Form Ⅱ)和2.85ng/ml (Form Ⅲ)。結(jié)論：成功構(gòu)建、表達和純化了具有生物學活性的3種不同亞型的重組人IL-8,為進一步的理論研究和大批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：白細胞介素-8 哺乳動物細胞 活性檢測 蛋白質(zhì)片段互補 Split-TEV
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 第一章 重組人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ蛋白表達和純化7-25
• 前言7
• 1.1 實驗材料與儀器7-9
• 1.1.1 菌株與載體7-8
• 1.1.2 工具酶與試劑8
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備8-9
• 1.2 實驗方法9-16
• 1.2.1 重組人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ表達載體構(gòu)建9-12
• 1.2.2 重組人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ蛋白表達12-14
• 1.2.3 重組人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ蛋白純化14-16
• 1.3 實驗結(jié)果與討論16-24
• 1.3.1 不同IL-8亞型的克隆及載體構(gòu)建16-17
• 1.3.2 HEK 293F細胞瞬時表達重組人IL-8 formⅠ蛋白17-18
• 1.3.3 大腸桿菌表達IL-8 FormⅠ和IL-8 FormⅡ重組蛋白18-20
• 1.3.4 重組人IL-8蛋白的純化20-24
• 1.4 結(jié)論24-25
• 第二章 重組人IL-8蛋白細胞內(nèi)生物學活性檢測25-37
• 前言25
• 2.1 實驗材料與儀器25-26
• 2.1.1 菌株、載體、基因模板25
• 2.1.2 工具酶與試劑25
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備25-26
• 2.2 實驗方法26-29
• 2.2.1 引物設(shè)計26-27
• 2.2.2 真核表達載體構(gòu)建27-28
• 2.2.3 不同亞型的重組人IL-8蛋白活性測定28-29
• 2.3 實驗結(jié)果與討論29-36
• 2.3.1 Split-TEV GPCR測活檢測系統(tǒng)原理29-31
• 2.3.2 Split-TEV GPCR測活檢測系統(tǒng)真核表達載體的構(gòu)建31-34
• 2.3.3 轉(zhuǎn)染與生物學活性檢測34-36
• 2.4 結(jié)論36-37
• 參考文獻37-39
• 綜述39-49
• 參考文獻46-49
• 致謝49-50

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