發(fā)布時間：2017-05-17 07:04

  本文關鍵詞：芳香烴受體AHR通過破壞DNA成環(huán)負向調控LPS誘導的骨橋蛋白OPN的表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：芳香烴受體(AHR)是一種被普遍接受的配體依賴性轉錄因子。最近的報告表明,AhR信號通路在許多免疫細胞,如T細胞,巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)中發(fā)揮重要作用。有各種AhR的配體,例如2,3,7,8-四氯-對-TCDD(TCDD),原初環(huán)境的AhR激動劑,調節(jié)Foxp3+Treg細胞和產IL-17輔助性T細胞(Th17細胞)的分化,并調節(jié)Thl/Th2平衡。未活化的AhR通常伴隨著熱休克蛋白90(HSP90)位于細胞質中。當與配體結合,AhR的構象發(fā)生變化,轉位到細胞核中,并與芳香烴受體核轉位蛋白(ARNT)結合形成異源二聚體,最后與目標基因的啟動子上的生物外源性應答元件(XRE)結合,從而導致各種調節(jié)效果。我們之前的研究中指出,通過巨噬細胞LPS活化后誘導NF-κB結合位點和AP-1結合位點之間的OPN啟動子DNA成環(huán),可以上調骨橋蛋白(OPN)的表達。然而對芳香烴受體調節(jié)基因表達的分子機制,尤其是在染色質水平的機制仍知之甚少。 因此我們從以下方面進行研究： 研究目的： 1.探討AhR是否調控LPS介導的OPN表達。 2.探索AhR調控LPS介導的OPN表達的作用機制。研究方法： 1.驗證LPS刺激下巨噬細胞中AhR表達,建立實驗體系。 1.1腹腔巨噬細胞分別用LPS處理指定的時間段。芳香烴受體mRNA的表達進行了檢查,同時做RT-PCR和定量PCR,Western blot檢測AhR蛋白質的表達。 1.2小鼠原代腹膜巨噬細胞,小鼠的脾細胞,和巨噬細胞株RAW264.7細胞中AhR的表達,RT-PCR法檢測。 2.AhR負調控LPS介導的OPN表達。 2.1.小鼠腹腔巨噬細胞或RAW264.7巨噬細胞用DMSO或lOnM TCDD進行預處理40分鐘,然后各期用LPS進行刺激。OPN表達,Western blot檢測。 2.2.小鼠腹腔巨噬細胞轉染對照siRNA或芳香烴受體siRNA36小時。芳香烴受體表達,Western blot檢測。 2.3.小鼠腹腔巨噬細胞轉染對照siRNA或芳香烴受體siRNA36小時,預先用DMSO或10nM的二惡英進行預處理40分鐘,然后用LPS刺激。OPN表達,Western blot檢測。 2.4.小鼠腹腔巨噬細胞轉染對照siRNA或芳香烴受體siRNA36小時.然后用LPS刺激。OPN表達,Western blot檢測。在三次獨立實驗中獲得類似的結果。 3.芳香烴受體結合OPN啟動子。 3.1小鼠腹腔巨噬細胞預先用DMSO或10nM的TCDD處理40分鐘,然后用LPS刺激,并且用ChIP實驗來評估小鼠中OPN啟動子的-2407至-2230區(qū)域內的AhR結合位點與AhR的結合�？偺崛∥镉米魃蠘訉φ�,并與無關抗體(抗actin)的免疫沉淀物用作陰性對照。小鼠OPN啟動子內不結合芳香烴受體位點的-1926至-1759區(qū)域擴增PCR產物用作特異性對照。 4.AhR活化后打破NF-κB和AP-1的DNA成環(huán)。 4.1小鼠腹腔巨噬細胞用DMSO或10nM的TCDD進行預處理40分鐘,然后用LPS刺激,然后使用引物A和引物B對OPN啟動子進行了3C測定。 4.2小鼠腹腔巨噬細胞用DMSO或10nM的TCDD進行預處理40分鐘,然后用LPS刺激,然后進行ChIP實驗來評估P300,p65及c-Jun蛋白對小鼠OPN啟動子中-1926到-1759區(qū)域內的NF-κB結合位點；以及-127至42區(qū) 域內的AP-1結合位點的結合情況�？偺崛∥镉米魃蠘訉φ�,以及無關抗體(抗actin)免疫沉淀用作陰性對照。結論及意義： 在本研究中我們揭示了芳香烴受體激動劑TCDD,可芳香烴受體依賴性的抑制LPS誘導的OPN產生。而siRNA敲除AhR的腹腔巨噬細胞中,LPS誘導OPN表達大大增加了。此外,我們證明TCDD處理后,AhR結合至外源性區(qū)域中的骨橋蛋白啟動子,并干擾NF-κB與AP-1介導的DNA成環(huán)。因此,我們的研究發(fā)現(xiàn)了新的機制,芳香烴受體可重塑染色質的結構和空間構象,調節(jié)基因的表達。
【關鍵詞】：
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 符號說明12-14
• 前言14-16
• 材料和方法16-30
• 實驗結果30-33
• 討論33-37
• 總結37-38
• 附圖38-42
• 參考文獻42-45
• 致謝45-46
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文46-47
• 學位論文評閱及答辯情況表47

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本文編號：372732