本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌DXS和DXR抑制劑高通量篩選模型的建立與應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來結(jié)核病卷土重來,耐藥、多藥耐藥以及廣泛耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)和傳播,使得尋找新的靶點及研發(fā)全新作用機制的高效低毒的抗結(jié)核藥物迫在眉睫。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)具有獨特而復(fù)雜的細胞壁結(jié)構(gòu),其涉及代謝途徑是公認的抗結(jié)核藥物優(yōu)質(zhì)靶標富集區(qū)。 類異戊二烯是MTB合成細胞壁結(jié)構(gòu)單元阿拉伯半乳聚糖和肽聚糖的骨架分子,也是參與能量代謝等多種生物過程的十分重要的生理活性物質(zhì)。2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸鹽(MEP)途徑是MTB合成類異戊二烯必需前體異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)的唯一途徑,該途徑為MTB生存所必需。MEP途徑與MTB的生長代謝密切相關(guān),而且該途徑不存在于哺乳動物細胞中，，使得催化該途徑的關(guān)鍵酶成為潛在的、具有較好選擇毒性的抗結(jié)核藥物的分子靶點。 本研究以MTB MEP途徑中關(guān)鍵酶DXS及DXR為研究對象,通過分子生物學(xué)方法,構(gòu)建了MTB DXS (MtDXS)和MTB DXR (MtDXR)蛋白的表達載體；優(yōu)化表達條件,獲得了可溶性表達的MtDXS和MtDXR蛋白；應(yīng)用Ni2+金屬螯合親和層析的方法對表達產(chǎn)物MtDXS和MtDXR進行了純化,獲得了兩個具有天然酶活性可溶性蛋白；建立了MtDXS和MtDXR的酶活測定體系,基于酶活測定體系構(gòu)建了靶向MtDXS和MtDXR的MtDXS-MtDXR偶聯(lián)抑制劑篩選模型及靶向MtDXR的MtDXR抑制劑篩選模型,通過研究底物濃度、反應(yīng)酶量、反應(yīng)溫度、DMSO等對反應(yīng)體系的影響,對篩選模型進行了優(yōu)化,并評價了優(yōu)化后模型的可行性；利用MtDXS-MtDXR禺聯(lián)模型對化合物庫中66400個化合物進行了篩選,得到了6個MtDXS抑制劑,經(jīng)抗結(jié)核活性評價獲得1個具有良好抗結(jié)核活性的化合物,命名為IMB-DXS-B1;通過MtDXS-MtDXR偶聯(lián)模型及MtDXR模型篩選得到了3個MtDXR抑制劑,經(jīng)抗結(jié)核活性評價獲得1個具有抗結(jié)核活性的化合物,命名為IMB-DXR-B1。 化合物IMB-DXS-B1和IMB-DXR-Bl在骨架結(jié)構(gòu)上完全不同于傳統(tǒng)的抗結(jié)核藥物,二者對MTB H37Rv的MIC分別為2～4μg/mL和32μg/mL,且對臨床分離的敏感及耐藥結(jié)核分枝桿菌均具有一定的活性；抗菌譜測定結(jié)果表明二者僅對MTB有較好的抑制活性,而對其他的病原微生物活性甚微。這些結(jié)果表明兩個化合物有可能發(fā)展成為全新作用機制的窄譜的抗耐藥MTB藥物。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 DXS DXR 高通量篩選模型 抑制劑 抗結(jié)核藥物
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-9
• 英文摘要9-10
• 前言10-14
• 實驗材料與儀器14-20
• 1 菌株及細胞14
• 2 質(zhì)粒14
• 3 培養(yǎng)基14-15
• 4 主要試劑15-16
• 5 溶液16-18
• 6 試劑盒18
• 7 工具酶18
• 8 主要儀器18-20
• 實驗方法20-44
• 1 重組MtDXS及MtDXR的生化特性預(yù)測20
• 2 重組MtDXS及MtDXR的表達質(zhì)粒的構(gòu)建及測序分析20-29
• 3 重組MtDXS及MtDXR的表達菌株構(gòu)建29
• 4 MtDXS和MtDXR蛋白的誘導(dǎo)表達29-30
• 5 MtDXS和MtDXR蛋白樣品的預(yù)處理30-31
• 6 MtDXS和MtDXR蛋白純化及蛋白質(zhì)含量測定31-33
• 7 純化蛋白的SDS-PAGE電泳檢測33-34
• 8 MtDXS及MtDXR活性測定原理及方法34-35
• 9 MtDXS和MtDXR酶穩(wěn)定性研究35-36
• 10 MtDXS和MtDXR酶活測定條件優(yōu)化36-38
• 11 MtDXS和MtDXR抑制劑高通量篩選模型的確立及應(yīng)用38-41
• 12 陽性化合物半數(shù)抑制濃度(IC_(50))測定41
• 13 陽性化合物最低抑菌濃度(MIC)的測定41-42
• 14 陽性化合物IMB-DXS-B1對MtDXS的酶動力學(xué)研究42
• 15 陽性化合物IMB-DXR-B1對MtDXR的酶動力學(xué)研究42
• 16 抗結(jié)核活性化合物對巨噬細胞毒性的初步評價42-44
• 實驗結(jié)果44-70
• 1 重組蛋白的生化特性44-45
• 2 重組表達質(zhì)粒pET28a-dxs及pET28a-dxr的構(gòu)建與驗證45-52
• 3 MtDXS和MtDXR蛋白的制備52-54
• 4 蛋白定量54-55
• 5 酶活測定結(jié)果55-56
• 6 重組蛋白穩(wěn)定性56-57
• 7 酶活測定條件的優(yōu)化57-64
• 8 MtDXS和MtDXR抑制劑高通量篩選模型的評價64
• 9 抑制劑篩選結(jié)果64-65
• 10 陽性化合物最低抑菌濃度(MIC)65-67
• 11 陽性化合物IMB-DXS-B1對MtDXS的動力學(xué)研究67-68
• 12 陽性化合物IMB-DXR-B1對MtDXR的動力學(xué)研究68
• 13 抗結(jié)核活性化合物對巨噬細胞毒性的初步評價68-70
• 討論70-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻74-76
• 文獻綜述76-89
• 參考文獻85-89
• 附錄89-99
• 致謝99

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