發(fā)布時間：2017-05-12 06:06

  本文關鍵詞：基于慢病毒載體和轉錄因子的人角膜基質細胞重編程研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：多能干細胞在再生醫(yī)學、組織工程和藥物發(fā)現(xiàn)與評價等領域極具應用價值，科學家們曾嘗試通過多種途徑獲取人的多能干細胞。但是現(xiàn)存方法的廣泛應用在技術、細胞來源、免疫排斥、倫理、宗教或法律等方面存在諸多限制，而iPS細胞能夠克服這些問題的限制，被譽為生命科學領域新的里程碑。隨著人類對干細胞分化調控機制認識的不斷加深，從人的iPS細胞將會衍生出更多種類的人類細胞，，iPS技術將成為細胞替代治療、新藥篩選與評價及其它用途（如提供大量的種子細胞）的基礎。 在組織工程人角膜基質的工作中，基質細胞是核心內容之一。人角膜基質細胞在體外培養(yǎng)時有良好的增殖能力，而且能夠長期發(fā)揮生物學功能。因此，獲得數(shù)量足夠、有再生活力的人角膜基質種子細胞是組織工程開展研究的前提和基礎。人角膜基質種子細胞的來源多種，包括異體細胞和自體細胞。在臨床應用中，異體細胞容易產生免疫排斥，這極大限制了它的應用。自體細胞獲取也有一定的困難：由于體細胞的體外增殖有一定限度，無法從很小的角膜基質組織中獲得大量的細胞，而獲取大量角膜基質組織又容易對正常角膜的結構和功能造成破壞；其他類型的自體細胞，如骨髓間充質干細胞、皮膚成纖維細胞或脂肪干細胞，亦不能完全替代角膜基質細胞的功能，無法成為組織工程角膜基質理想的種子細胞。 人胚胎干細胞在體外有分化成各種細胞類型的能力，iPS細胞的發(fā)明讓人們可以從自身體細胞獲得大量的、無免疫原性的多能干細胞，因此iPS細胞來源的角膜基質細胞成為了組織工程人角膜基質種子細胞的非常有希望的候選。但是由于人們在人角膜基質細胞分化的分子機制方面缺少足夠的研究，導致很難在體外定向地將iPS細胞分化成足夠多的、純凈的角膜基質細胞用于臨床。最近有大量研究證實iPS細胞帶有來源細胞的表觀遺傳學記憶，iPS細胞基因組中與來源細胞有關聯(lián)的甲基化組也影響了它們的分化傾向，這一發(fā)現(xiàn)啟示我們可以充分利用iPS細胞的表觀遺傳學記憶，來完成那些困難的定向分化。 本文中我們首先對人角膜基質細胞進行了原代培養(yǎng)。將去除上皮和內皮細胞層的人角膜基質進行機械分割，在培養(yǎng)板上進行貼壁培養(yǎng)，后將遷出的角膜基質細胞進行傳代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的人角膜基質細胞具有樹突狀形狀特征，核型鑒定發(fā)現(xiàn)其染色體具有人類染色體的典型特征，免疫熒光檢測表明體外培養(yǎng)的基質細胞均為波形蛋白陽性表達，且不含角膜上皮細胞和角膜內皮細胞。 隨后我們用293T細胞以及第二代慢病毒包裝質粒系統(tǒng)制作了分別攜帶Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種外源性基因的慢病毒，感染效率測定發(fā)現(xiàn)當病毒數(shù)量與細胞數(shù)量之比為10:1時，感染效率超過80%。我們用四種病毒共同感染角膜基質細胞，感染后將細胞消化、接種到預先鋪有Matrigel基質膠的培養(yǎng)板上，將培養(yǎng)液換為小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)層條件培養(yǎng)液，開始iPS細胞的誘導。誘導后第三天細胞開始出現(xiàn)了形態(tài)的改變，產生大量上皮樣及圓形的細胞，誘導后第七天到第九天，培養(yǎng)板中開始出現(xiàn)人胚胎干細胞樣的細胞類型，它們的核質比較大，細胞連接緊密，成克隆樣生長。誘導第二十天，胚胎干細胞樣的細胞團已經非常明顯，我們進行了多能性干細胞的功能標志之一，堿性磷酸酶染色，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)板中有大量堿性磷酸酶陽性細胞，初步確定已成功誘導人角膜基質細胞成為iPS細胞，誘導效率為0.4%-0.8%。 綜上所述，本文將人角膜基質細胞重編程為iPS細胞，賦予角膜基質細胞無限的增殖能力，為獲得大量的種子細胞奠定基礎。我們希望在不久的將來，在此工作的基礎上利用iPS細胞表觀遺傳學記憶，使大量擴增的角膜基質細胞來源的iPS細胞重新定向分化為角膜基質細胞，滿足組織工程對種子細胞的需求。另外我們還可以將此iPS細胞分化為跟角膜基質細胞在發(fā)育上關系相近的角膜中其它類型的細胞，比如說角膜內皮細胞和角膜上皮細胞，從而獲得這些數(shù)量稀少且在體外難于培養(yǎng)的細胞類型，用于疾病治療或理論研究。
【關鍵詞】：誘導性多能干細胞 人角膜基質細胞 Yamanaka因子 慢病毒 重編程
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q813;R329.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文獻綜述12-25
• 1. 發(fā)育過程中的多能干細胞13-15
• 1.1 胚胎干細胞13-14
• 1.2 外胚層干細胞14
• 1.3 胚胎生殖細胞和成體生殖系干細胞14-15
• 2. 多能干細胞的分類15-16
• 2.1 兩種基本的多能性狀態(tài)15-16
• 2.2 兩種多能性狀態(tài)的維持和轉化16
• 3. 人胚胎干細胞16-19
• 3.1 人胚胎干細胞的多能性狀態(tài)16-17
• 3.2 人胚胎干細胞在研究中遇到的問題17
• 3.3 核移植技術17-18
• 3.4 誘導性多能干細胞（iPS 細胞）18-19
• 4. 胚胎干細胞與 iPS 細胞的異同19-22
• 4.1 iPS 細胞與胚胎干細胞的多能性基因表達相近19-20
• 4.2 iPS 細胞與胚胎干細胞的功能相似20
• 4.3 iPS 細胞與胚胎干細胞之間存在的差異20-22
• 5. iPS 細胞的表觀遺傳學記憶22-25
• 第二章 人角膜基質細胞的原代培養(yǎng)與鑒定25-32
• 1. 材料用品25-26
• 1.1 材料25-26
• 1.2 主要儀器26
• 1.3 藥品與耗材26
• 1.4 常用溶液26
• 2. 實驗方法26-27
• 2.1 人角膜基質細胞的原代培養(yǎng)26
• 2.2 人角膜基質細胞的傳代培養(yǎng)26-27
• 2.3 人角膜基質細胞核型分析27
• 2.4 人角膜基質細胞免疫化學檢測27
• 3 實驗結果27-29
• 3.1 人角膜基質細胞的原代培養(yǎng)27-28
• 3.2 人角膜基質細胞的傳代培養(yǎng)28
• 3.3 人角膜基質細胞染色體核型分析28
• 3.4 人角膜基質細胞特征蛋白的免疫化學檢測28-29
• 4 討論29-32
• 第三章 從人角膜基質細胞到誘導性多能干細胞32-44
• 1 材料用品32-33
• 1.1 材料32
• 1.2 藥品與耗材32-33
• 1.3 常用溶液配方33
• 2 實驗方法33-35
• 2.1 質粒的轉化及提取33-34
• 2.2 慢病毒的產生和滴度測定34
• 2.3 慢病毒最佳 MOI 測定34
• 2.4 iPS 細胞的誘導34-35
• 3 實驗結果35-40
• 3.1 質粒的提取及酶切鑒定35-36
• 3.2 用 293T 細胞包裝慢病毒36-37
• 3.3 用 293T 細胞測量病毒滴度37-38
• 3.4 確定病毒感染人角膜基質細胞的最佳 MOI38-39
• 3.5 人 iPS 細胞的誘導39-40
• 3.6 人 iPS 細胞誘導效率測定40
• 4 討論40-44
• 參考文獻44-49
• 致謝（一）49-50
• 致謝（二）50-51
• 附件51-52

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：基于慢病毒載體和轉錄因子的人角膜基質細胞重編程研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：358925