本文關鍵詞：申克孢子絲菌雙相型轉換相關基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：申克孢子絲菌是一種重要的雙相型真菌，是孢子絲菌病的主要病原菌。近年來，免疫缺陷或受損患者的增加，導致全球范圍內孢子絲菌病發(fā)病率逐年升高，且深部和系統(tǒng)性孢子絲菌病的病例不斷增多，已嚴重地影響到人類的健康，引起了廣泛的關注、成為研究的熱點之一。 本研究以申克孢子絲菌為研究對象，利用反向遺傳學、生物信息學及分子生物學等手段，首次建立了分離自肺孢子絲菌病患者的申克孢子絲菌分離株的T-DNA插入突變體庫；篩選并鑒定雙相型轉換相關基因；通過構建基因敲除株和回復突變株來解析基因功能，以此明確雙相型轉換相關機制，為深入研究申克孢子絲菌的致病機制、防控孢子絲菌及新型抗真菌藥物的研發(fā)病奠定理論基礎和提供科學依據(jù)。 1.申克孢子絲菌IFM41598的T-DNA插入突變體庫的建立 本研究首次利用根癌農桿菌介導的T-DNA插入技術建立了申克孢子絲菌IFM41598的T-DNA插入突變體系，具體條件為：將濃度為2106個/mL的申克孢子絲菌分生孢子與OD值為0.5-0.8的攜帶pBHt1質粒的根癌農桿菌AGL-1等比例混合，在存在200μ M AS的條件下，誘導培養(yǎng)48h，經150μ g/mL濃度的潮霉素篩選，25培養(yǎng)5d可獲得800個轉化子/2106個分生孢子，經過多次轉化，共獲得了轉化子3000株，，初步建立了申克孢子絲菌IFM41598的T-DNA插入突變體庫。這一突變體庫的建立將為研究深部和系統(tǒng)性孢子絲菌病的病原菌提供材料，為解析基因功能，探討致病機制奠定基礎。 2.雙相型轉換相關基因的篩選和鑒定 利用已經建立的突變體庫，以庫中3000株突變體為研究材料，利用平板法對雙相型轉換發(fā)生改變的突變體進行篩選，共計篩選獲得18株形態(tài)轉換發(fā)生異常的突變體；利用TAIL-PCR技術、測序技術及生物信息學分析，定位了6株突變體的打斷序列，分別為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因2個、交配性基因2個、己糖轉運蛋白基因及自然抗性相關巨噬細胞蛋白基因。 3.雙相型轉換相關基因敲除株和回復突變株的構建 利用分子克隆技術、重疊延伸PCR技術及PEG介導的原生質體轉化技術構建了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因（STPK）和己糖轉運蛋白基因的敲除株；利用Split-Marker重組技術和PEG介導的原生質體轉化技術獲得了兩個交配性基因的敲除株；利用酶切和連接方法結合根癌農桿菌介導的轉化技術獲得了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（STE）基因和自然抗性相關巨噬細胞蛋白基因的敲除株；利用吡啶硫胺素作為第二抗性構建了上述6株基因敲除株對應的回復突變株。構建的雙相型轉換相關基因敲除株和回復突變株，將為解析這些基因功能和闡明雙相型轉換相關機制提供材料保障，多種方法實現(xiàn)了對申克孢子絲菌進行基因敲除為研究其他真菌提供技術支撐。 4.雙相型轉換相關基因功能研究 對基因敲除株的形態(tài)學改變、藥物敏感性改變、細胞組成成分改變及致病力改變進行研究。六株菌的的形態(tài)均有不同程度的改變，主要變化為菌落顏色改變、分生孢子產生減少、菌落酵母相形成障礙等方面；六株菌的對藥物的普遍抵抗能力均有所下降；細胞組分有不同程度增加；菌株的致病力均有不同程度的降低。上述結果表明申克孢子絲菌雙相型轉換是由多種原因引起的，解析相關基因功能，明確相關作用機制將為雙相型真菌的形態(tài)轉換、致病機制及感染的防治等研究提供參考和根據(jù)。 綜上，本研究建立了系統(tǒng)性孢子絲菌病分離株申克孢子絲菌IFM41598容量為3000株的小規(guī)模T-DNA隨機插入突變體庫，篩選并鑒定了6個雙相型轉換相關基因，構建了這些基因的敲除株和回復突變株，初步解析了基因功能，為深入解析病原真菌的基因功能、探討致病機制、抗真菌藥物的研發(fā)奠定基礎，對于其它真菌的研究，亦能提供有價值的參考資料。
【關鍵詞】：申克孢子絲菌 雙相型轉換 基因 基因敲除 同源重組
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R379
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 目錄9-13
• 第1章 緒論13-23
• 1.1 申克孢子絲菌與孢子絲菌病13-14
• 1.2 雙相型真菌和雙相型轉換14-18
• 1.3 絲狀真菌的基因敲除技術18-21
• 1.4 本研究的立題依據(jù)、研究內容及意義21-23
• 第2章 雙相型轉換相關基因篩選與鑒定23-39
• 2.1 實驗材料23-24
• 2.2 主要試劑和培養(yǎng)基配制24-26
• 2.3 主要引物26-27
• 2.4 實驗方法27-31
• 2.5 結果31-36
• 2.6 討論36-39
• 第3章 申克孢子絲菌雙相型轉換相關基因的定向敲除39-72
• 3.0 實驗材料39-43
• 3.1 根癌農桿菌介導的 Nramp 基因和 STE 基因的定向敲除43-51
• 3.2 Overlap -PCR 介導的 MFS 基因和 STPK 基因的定向敲除51-56
• 3.3 Split-Marker 技術介導的 MAT1 基因和 MAT2 基因定向敲除56-58
• 3.4 回復突變株的構建58-61
• 3.5 結果61-70
• 3.6 討論70-72
• 第4章 雙相型轉換相關基因功能和作用機制研究72-88
• 4.1 實驗材料72-73
• 4.2 實驗方法73-77
• 4.3 結果77-86
• 4.4 討論86-88
• 第5章 結論88-89
• 參考文獻89-98
• 作者簡介及在學期間取得科研成果98-101
• 致謝101-102

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳敏;廖萬清;;孢子絲菌病的治療[J];皮膚病與性病;2010年03期

2 陳裕充;;孢子絲菌病[J];中國真菌學雜志;2008年04期

3 萬雪;賀丹;王麗;;申克孢子絲菌毒力因子及宿主抗感染免疫的研究進展[J];中國真菌學雜志;2013年05期

  本文關鍵詞：申克孢子絲菌雙相型轉換相關基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：358606