本文關(guān)鍵詞：調(diào)節(jié)Matriptase-2表達(dá)，活化以及胞外段脫落（酶切）的分子學(xué)機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶（Type Ⅱ Transmembrane Serine Protease，TTSPs）是一類(lèi)通過(guò)氨基末端跨膜區(qū)域錨定在細(xì)胞膜上的蛋白酶，在哺乳動(dòng)物的許多病理、生理過(guò)程中扮演著重要的角色，其功能異常可導(dǎo)致癌癥、缺鐵性貧血、耳聾、心血管疾病等。在人類(lèi)，TTSPs共有17個(gè)成員，其中對(duì)matriptase-2的研究比較少，目前對(duì)其生物學(xué)功能的了解，主要是它可以通過(guò)調(diào)控hepcidin的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)；除此之外，有研究表明它在乳腺癌和睪丸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起到一定的作用，但在這些疾病的發(fā)生發(fā)展中，matriptase-2的具體生物學(xué)功能并不明確。目前已知，matriptase-2的活化和胞外段脫落是其發(fā)揮自身功能的前提條件，但是對(duì)于調(diào)節(jié)matriptase-2表達(dá)，活化和胞外段脫落（酶切）的分子機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探究調(diào)節(jié)matriptase-2的表達(dá)，活化以及胞外段脫落（酶切）的分子學(xué)機(jī)制。 方法： （1）利用RT-PCR，PCR從人肝臟組織中提取出matriptase-2基因，然后連接到帶有V5標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒中； （2）matriptase-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293和肝癌細(xì)胞，然后利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢驗(yàn)matriptase-2在這些細(xì)胞中能否成功表達(dá)； （3）免疫共沉淀收集條件培養(yǎng)基中的可溶性matriptase-2片段； （4）用生物素標(biāo)記和免疫共沉淀分離、提取膜蛋白； （5）利用蛋白酶抑制劑，免疫共沉淀以及western blot探究哪類(lèi)蛋白酶抑制劑能抑制matriptase-2胞外段脫落； （6）利用點(diǎn)突變阻斷對(duì)matriptase-2活性至關(guān)重要的兩個(gè)位點(diǎn)，用來(lái)探究matriptase-2能否自身活化；同樣地，利用點(diǎn)突變分別阻斷matriptase-2上的七個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)，用來(lái)研究各個(gè)糖基化位點(diǎn)對(duì)matriptase-2的表達(dá)，活化和胞外段脫落（酶切）的影響； （7）Western blot分析matriptase-2在細(xì)胞裂解液，上清以及膜蛋白中的表達(dá)，活化以及胞外段脫落情況； 結(jié)果： （1）利用RT-PCR和PCR成功從人肝組織中提取到matriptase-2cDNA，連接到帶有V5標(biāo)簽的質(zhì)粒后，經(jīng)測(cè)序所有的堿基序列與人matriptase-2基因序列保持一致。 （2）重組matriptase-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞HEK293和肝癌細(xì)胞BEL7402后，利用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)到錨定于細(xì)胞膜上的matriptase-2，，這表明我們所建立的細(xì)胞模式很成功，能夠用于以后的實(shí)驗(yàn)。 （3）用Western blot和免疫共沉淀分析matriptase-2在HEK293和肝癌細(xì)胞（BEL-7402、SMMC-7721、QGY-7703）中的活化情況。結(jié)果表明matriptase-2在HEK293細(xì)胞中的活化和胞外段脫落（酶切）情況與在肝癌細(xì)胞中是一致的；其中~30kDa條帶為matriptase-2的活化條帶。 （4）利用免疫共沉淀和western blot，檢測(cè)在條件培養(yǎng)基中加入各種蛋白酶抑制劑（GM6001、ALLM、benzamidine(benz)、TAPI-1）后，上清中是否存在可溶性Matriptase-2片段。結(jié)果顯示，在加入絲氨酸蛋白酶抑制劑（benzamidine）后，條件培養(yǎng)基（opti-MEM，沒(méi)有血清的培養(yǎng)基）中的可溶性matriptase-2均顯著減少；而加入其它蛋白酶抑制劑后，條件培養(yǎng)基中的matriptase-2保持不變。 （5）利用點(diǎn)突變得到致使matriptase-2失去活性的R576A和S762A（R576—活化酶切位點(diǎn)被突變掉；S762A—催化區(qū)中對(duì)自身活性至關(guān)重要的一個(gè)位點(diǎn)被突變掉）。然后，通過(guò)western blot檢測(cè)這兩個(gè)突變體的條件培養(yǎng)基中是否存在可溶性matriptase-2片段。結(jié)果顯示，兩個(gè)突變體的條件培養(yǎng)基（opti-MEM，沒(méi)有血清的培養(yǎng)基）中均沒(méi)有可溶性matriptase-2片段。 （6）利用生物素標(biāo)記提取膜蛋白，然后western blot分析matriptase-2在細(xì)胞膜上的活化情況。結(jié)果顯示，在表達(dá)野生型matriptase-2的HEK293和BEL7402的膜蛋白中，檢測(cè)到~30kDa的條帶；在表達(dá)matriptase-2的兩個(gè)突變體（R576A、S762A）的膜蛋白中，沒(méi)有檢測(cè)到~30kDa的條帶。~30kDa條帶為matriptase-2的活化條帶。 （7）利用western blot分析matriptase-2的糖基化修飾類(lèi)型。結(jié)果顯示，在加入PNGase F的細(xì)胞裂解液中，matriptase-2的分子量下降；加入O-glycanase的細(xì)胞裂解液中，matriptase-2的分子量沒(méi)有變化；而在加入PNGase F+O-glycanase的細(xì)胞裂解液中，matriptase-2的分子量亦下降，鑒于糖基化修飾分為N-糖基化修飾和O-糖基化修飾，故而我們得出matriptase-2的糖基化修飾主要是N-糖基化修飾。 （8）利用點(diǎn)突變分別阻斷matriptase-2的七個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)，得到N136Q、N184Q、N216Q、N338Q、N433Q、N453Q、N518Q七個(gè)突變體，然后通過(guò)免疫共沉淀和western blot分析這七個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)對(duì)其表達(dá)，活化和胞外段脫落（酶切）的影響。結(jié)果表明這些糖基化修飾位點(diǎn)并不影響matriptase-2表達(dá)以及在細(xì)胞膜上的錨定。然而，N216Q、N453Q和N518Q卻能明顯抑制matriptase-2的活化，進(jìn)而阻止了matriptase-2從細(xì)胞膜上的脫落（酶切），而其他5個(gè)突變體并沒(méi)有影響到matriptase-2的活化和酶切。 結(jié)論：我們比較系統(tǒng)全面地研究了matriptase-2在HEK293和肝癌細(xì)胞中的活化和酶切情況，我們發(fā)現(xiàn)matriptase-2在胞漿中無(wú)法被活化，但是錨定在膜上后可以通過(guò)自我酶切使自身活化，并且活化的matriptase-2可以酶切自身進(jìn)而與胞膜脫落。我們也發(fā)現(xiàn)了N-糖基化修飾對(duì)matriptase-2的活化和胞外段脫落（酶切）具有重要的影響但并不影響其表達(dá)以及到膜上的錨定�？傊�，我們的結(jié)果為研究調(diào)節(jié)matriptase-2的表達(dá)，活化，胞外段脫落（酶切）的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。
【關(guān)鍵詞】：Matriptase-2 Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶 糖基化修飾
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 一、引言13-16
• 二、材料與方法16-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-19
• 2.1.1 細(xì)胞系16
• 2.1.2 只要試劑和材料16-18
• 2.1.3 主要儀器和設(shè)備18
• 2.1.4 常用緩沖液及配制18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-27
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)19
• 2.2.2 RNA 提取19-20
• 2.2.3 RT-PCR 和 PCR20-22
• 2.2.4 回收純化目的基因22-23
• 2.2.5 目的基因與載體（質(zhì)粒）連接23
• 2.2.6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)23-24
• 2.2.7 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)24
• 2.2.8 免疫共沉淀24-25
• 2.2.9 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）25-26
• 2.2.10 膜蛋白分離提取實(shí)驗(yàn)26-27
• 三、結(jié)果27-37
• 3.1 重組蛋白（MT2-V5）在 HEK 293 和 BEL 7402 細(xì)胞膜上定位情況27-28
• 3.2 Matriptase-2 在細(xì)胞裂解液和上清中的活化、酶切情況28-30
• 3.3 蛋白酶抑制劑對(duì) Matriptase-2 胞外段脫落（酶切）的影響30-31
• 3.4 Matriptase-2 的自切31-32
• 3.5 Matriptase-2 在細(xì)胞膜上的活化情況32-34
• 3.6 糖基化修飾對(duì) Matriptase-2 表達(dá)，活化以及胞外段脫落（酶切）的影響34-37
• 四、討論37-40
• 五、展望40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 綜述：Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶的研究進(jìn)展45-56
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文56-57
• 縮略詞表57-59
• 致謝59-61

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：調(diào)節(jié)Matriptase-2表達(dá)，活化以及胞外段脫落（酶切）的分子學(xué)機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：347773