發(fā)布時間：2017-05-02 09:07

  本文關鍵詞：人CD96分子胞膜外第一結構域的晶體結構和功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：NK細胞,即自然殺傷細胞(natural killer cell)是人體固有免疫系統(tǒng)中的重要組成部分之一。當外來病原微生物抗原侵襲時,先天免疫系統(tǒng)可以作為機體的第一道天然防線,迅速活化并對病原體進行殺傷,該殺傷作用發(fā)生在人體獲得性免疫系統(tǒng)啟動之前,在腫瘤細胞和病毒感染的免疫反應中起著十分重要的屏障作用。NK細胞受到表達于其表面的活化性受體和抑制性受體的共同調(diào)控。近年來,對NK細胞識別腫瘤細胞的機制研究發(fā)現(xiàn),其識別機制十分多樣化,表達于其表面的各種受體得到了研究者的關注,尤其是一些活化性受體。 CD96(Tactile)是一個主要表達在活化的T細胞,NK細胞上的免疫受體分子。它屬于免疫球蛋白超家族,胞外區(qū)有3個免疫球蛋白結構域(V1,V2/C和C)。CD96的配體是表達于腫瘤細胞上的CD155,最近的研究表明,CD96的第一個IgV結構域(CD96V1)是與CD155特異性結合的主要部位,在NK細胞粘附和NK細胞介導的殺傷腫瘤細胞的過程中起著重要的作用。 CD96分子的結構尚未解析,我們通過生物信息學對CD96分子進行分析,發(fā)現(xiàn)與CD96有一定同源性的分子主要有CD226,CD86,CD113和CD166,其中CD166和CD226與CD96同源性較高。研究表明,表達于NK細胞表面的受體CD226和CD96兩者都參與免疫應答,都屬于激活性受體,向細胞內(nèi)傳遞活化型信號,從而引發(fā)多種免疫學效應。但是目前來說,對細胞間黏附分子相互作用的機制還在探索和研究中。我們已知CD96和CD226都是免疫球蛋白超家族中的成員,其胞膜外區(qū)具有相似的空間結構,并且CD96第一個V樣結構域和CD226的V樣結構域同源性為29%,CD226和CD96有共同的配體CD155,CD226的結構的解析或許能為CD96的結構解析提供一些有價值的數(shù)據(jù)作為參考,從而為揭示CD96與CD155作用的機制奠定結構基礎。 本研究構建了人類CD96第一個IgV樣結構域(hCD96V1)的表達載體,并將它在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中以包涵體形式表達。通過包涵體體外復性,我們得到了CD96可溶性蛋白。分析超速離心結果證明CD96可溶蛋白在體外以二聚體形式存在。采用座滴氣相擴散法獲得了衍射質(zhì)量較好的CD96蛋白晶體,衍射分辨率為1.9A,晶體屬于空間群P21,晶胞參數(shù)為a=35.1,B=69.5,C=49.6A,α＝γ＝90°,β=105.4°。于此同時,我們通過CD96V1四聚體染色技術驗證了CD96第一V樣結構域與CD155結合的實驗。并預測了CD96V1上的幾個親水性氨基酸可能與CD96二聚體的形成有關。為后續(xù)的結構和功能研究奠定了基礎。
【關鍵詞】：CD96 第一IgV結構域 細胞粘附分子 蛋白純化 結晶
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392;R3416
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 目錄6-9
• 1 文獻綜述9-20
• 1.1 NK細胞研究進展概述9-15
• 1.1.1 NK細胞9
• 1.1.2 NK細胞功能和活化機制9-11
• 1.1.3 NK細胞的受體11-13
• 1.1.4 NK細胞與腫瘤細胞的殺傷機制13-15
• 1.2 CD96分子的研究進展15-20
• 1.2.1 CD96的發(fā)現(xiàn),及結構特征15-17
• 1.2.2 CD96同源性分子17-18
• 1.2.3 CD96的識別與活化機制的研究進展18-20
• 2 引言20-21
• 3 材料和方法21-40
• 3.1 主要試劑和儀器21-26
• 3.1.1 細胞與基因21
• 3.1.2 引物21-22
• 3.1.3 載體質(zhì)粒22
• 3.1.4 儀器22-23
• 3.1.5 試劑及試劑盒23-24
• 3.1.6 溶液配制24-26
• 3.2 技術路線26-27
• 3.3 實驗方法27-40
• 3.3.1 CD96V1-pET21a表達質(zhì)粒的構建27-31
• 3.3.2 CD96V1結構域的小量表達分析31-32
• 3.3.3 CD96V1結構域包涵體的大量制備32
• 3.3.4 CD96V1結構域包涵體的復性32-33
• 3.3.5 CD96V1結構域蛋白的純化33-34
• 3.3.6 CD96V1結構域蛋白的結晶34
• 3.3.7 CD96V1結構域蛋白的Sulfo-EGS交聯(lián)實驗34
• 3.3.8 CD96V1結構域蛋白分析超速離心34-35
• 3.3.9 CD96V1生物素化及其突變體生物素化克隆的構建35-37
• 3.3.10 CD96V1及其突變體生物素化和四聚體制備37-38
• 3.3.11 CD155真核表達載體構建38
• 3.3.12 細胞培養(yǎng)及表達CD155的細胞鑒定38-39
• 3.3.13 CD155-GFP轉(zhuǎn)染CHO細胞39
• 3.3.14 CD96V1及其突變體的四聚體染色39-40
• 4 結果與分析40-55
• 4.1 CD96V1原核表達質(zhì)粒的構建40-41
• 4.2 CD96V1結構域的小量表達分析41-42
• 4.3 CD96V1結構域蛋白的純化42-44
• 4.4 CD96V1結構域蛋白結晶的生長44-45
• 4.5 CD96V1結構域蛋白SULFO-EGS交聯(lián)實驗45-46
• 4.6 CD96V1結構域蛋白分析超速離心46
• 4.7 CD96V1結構域晶體的衍射數(shù)據(jù)收集及處理46-47
• 4.8 CD96V1結構域及其突變體(生物素化)克隆的構建47-50
• 4.9 CD96V1結構域及其突變體(生物素化)四聚體蛋白的制備50-51
• 4.10 細胞培養(yǎng)及表達CD155的細胞鑒定51-52
• 4.11 CD155真核表達載體的構建52-53
• 4.12 CD155-GFP轉(zhuǎn)染CHO細胞53
• 4.13 CHO細胞染色及流式細胞術鑒定53-55
• 5 討論與展望55-57
• 5.1 CD96V1結構域晶體結構分析的意義55
• 5.2 CD96二聚體形成的作用力55-56
• 5.3 CD96分子的展望56-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-62
• 附錄62-65
• 縮略詞表62-64
• 載體圖譜64-65
• 致謝65-66
• 作者簡介66

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 William H.D.Hallett;William J.Murphy;;Natural Killer Cells:Biology and Clinical Use in Cancer Therapy[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年01期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 肖平;急性白血病亞型的免疫表型和蛋白質(zhì)組學比較研究[D];暨南大學;2008年

2 謝薇;骨髓增生異常綜合征發(fā)病機制的探索性研究[D];華中科技大學;2010年

  本文關鍵詞：人CD96分子胞膜外第一結構域的晶體結構和功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：340652