本文關(guān)鍵詞：分枝桿菌RskA蛋白不同表達(dá)水平的生理效應(yīng)分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前全球人群結(jié)核分枝桿菌感染嚴(yán)重,約有20億人(世界人口的三分之一)已經(jīng)感染了結(jié)核分枝桿菌。雖然國(guó)際社會(huì)一直給予極大的關(guān)注,各國(guó)政府也一直致力于結(jié)核病防治工作,結(jié)核病仍然嚴(yán)重危害著人們的健康。特別是近年來耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)和HIV共感染更使得結(jié)核防治工作變得任重道遠(yuǎn)。 對(duì)于流行疾病的控制,有效的早期診斷和早期治療無疑是整個(gè)防治環(huán)節(jié)中的首選切入點(diǎn)。鑒于此,開發(fā)新的抗結(jié)核的藥物和疫苗,顯得尤為迫切。但目前,對(duì)于結(jié)核桿菌致病、耐藥和潛伏的機(jī)制尚不明了。對(duì)相關(guān)機(jī)制的探究,將會(huì)幫助我們更好的了解結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌,也將為藥物和疫苗的研發(fā)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中存在著大量可以被CD8+T細(xì)胞所識(shí)別的蛋白抗原。MPB70和MPB83就是結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中的主要分泌蛋白,也是一類保護(hù)性抗原。而MPB70和MPB83抗原蛋白的表達(dá)受到sigK(Rv0445c)的調(diào)節(jié)作用。與其臨近的Rv0444C基因編碼anti-sigK因子RskA,可以抑制SigK的功能。同時(shí),我們?cè)谧銮捌谂R床菌株分型的過程中,注意到部分臨床菌株中Rv0444c(242位)發(fā)生了單堿基突變(G→C),導(dǎo)致其編碼的81位密碼子由谷氨酸突變?yōu)樘於彼岬腻e(cuò)義突變。這一突變導(dǎo)致了anti-SigK因子失活,從而解除了對(duì)SigK的抑制,最后導(dǎo)致了抗原蛋白MPB70和MPB83發(fā)生表達(dá)變化。 而MPB70和MPB83又是一組與細(xì)菌毒力有關(guān)聯(lián)性的抗原蛋白。因此我們希望通過此次實(shí)驗(yàn),嘗試揭示不同RskA表達(dá)情況,以及242位錯(cuò)義突變對(duì)菌株毒力和胞內(nèi)存活能力的影響,為更進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌毒力、探究結(jié)核病發(fā)病機(jī)制做一些鋪墊。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了RskA高表達(dá)菌株(RskA-High)、RskA低表達(dá)株(RskA-Low)、突變株(RskA-Mut),以及pMV261、pACT空質(zhì)粒重組對(duì)照菌株,觀察發(fā)現(xiàn)不同RskA蛋白表達(dá)水平對(duì)菌體、菌落形態(tài)無明顯影響。而不同條件環(huán)境下胞外群體生長(zhǎng)情況差異,和不同菌株胞內(nèi)生長(zhǎng)情況的差異顯示,RskA-High菌株在胞內(nèi)/低氧環(huán)境中表現(xiàn)出更好的適應(yīng)性。RskA-Low菌株則表現(xiàn)出對(duì)胞內(nèi)/低氧環(huán)境的不耐受。 而RskA不同表達(dá)水平的各菌株攻擊THP1細(xì)胞后,刺激誘導(dǎo)TNF-α水平的差異證實(shí),RskA-High菌株刺激THP1細(xì)胞分泌TNF-α量更少,初步佐證了RskA-High菌株RskA蛋白高表達(dá)后抑制SigK因子,并負(fù)向調(diào)控毒力相關(guān)蛋白MPB70、MPB83。而菌株毒力的下降,使得菌株刺激細(xì)胞因子分泌的能力下降,從而更容易在胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)免疫逃逸,顯示出較為良好的適存能力。 為進(jìn)一步獲得佐證,基于RskA低表達(dá)菌株在胞內(nèi)無法正常生長(zhǎng),我們選擇了RskA-High、RskA-Mut和pMV261空質(zhì)粒對(duì)照菌株,采取尾靜脈注射的方式攻擊C57BL/6小鼠,同時(shí)設(shè)置PBS組等量注射作為對(duì)照。7d、14d、21d、28d分批處死小鼠,觀察活力情況變化、臟器和尾部表觀變化,并對(duì)肺脾組織進(jìn)行固定制片,通過HE染色進(jìn)行病理檢測(cè)分析。小鼠臟器超微結(jié)構(gòu)的變化差異,顯示出RskA-High菌株對(duì)小鼠臟器造成的損害較輕,提示RskA-High菌株毒力相對(duì)較弱,也進(jìn)一步證實(shí)了RskA對(duì)于結(jié)核分枝桿菌MPB70和MPB83兩種蛋白表達(dá)情況的負(fù)調(diào)控。 綜上所述,我們對(duì)RskA/SigK調(diào)節(jié)毒力相關(guān)蛋白進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,通過胞內(nèi)外細(xì)菌的培養(yǎng)情況,確認(rèn)了RskA高表達(dá)菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的胞內(nèi)生存能力。菌株攻擊細(xì)胞后相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)和小鼠的病理檢測(cè)結(jié)果也顯示,這一適應(yīng)性是RskA高表達(dá)菌株通過負(fù)調(diào)控毒力相關(guān)蛋白,使得菌株減毒,減弱細(xì)胞免疫應(yīng)答來達(dá)成的。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核病 RskA/SigK調(diào)控 MPB70/83蛋白 菌株毒力 病理檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 第一章 文獻(xiàn)綜述7-15
• 第一節(jié) 結(jié)核病與結(jié)核病現(xiàn)狀概況7-10
• 第二節(jié) 海分枝桿菌——研究結(jié)核的良好模型10-11
• 第三節(jié) 結(jié)核分枝桿菌中的sigma因子家族11-15
• 第二章 實(shí)驗(yàn)試劑和材料15-43
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料15-22
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法22-43
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-61
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析討論與展望61-68
• 第一節(jié) 結(jié)果分析與討論61-65
• 第二節(jié) 小結(jié)與后續(xù)展望65-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 碩士期間的科研成果75-76
• 致謝76-78

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1 鐘江;;病原體毒力的進(jìn)化[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊(cè));2003年05期

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本文編號(hào)：339157