發(fā)布時間：2021-09-07 15:03

　　研究背景：作為一種高效的基因調控手段，RNA干擾具有靶點專一、用量小等優(yōu)點，被廣泛應用于基因治療等領域。傳統(tǒng)的短發(fā)夾RNA載體雖然解決了常規(guī)小RNA短時效的缺點，但卻伴隨嚴重的細胞毒作用�；趦仍磎icroRNA的新一代人工microRNA載體（amiRNA）可以很好解決載體安全性問題，表達效率卻不盡如人意。如何提高amiRNA載體的表達效率是目前小RNA載體急需解決的問題，amiRNA載體的優(yōu)化工作對推動RNA干擾研究及其基因藥物的發(fā)展意義重大。研究目的：本論文的主要目的是解決目前amiRNA載體表達中存在的瓶頸問題，獲得高表達效率的新型amiRNA載體，加速小RNA基因藥物的臨床應用。研究方法：（1）利用Block-iT RNAi Designer軟件設計靶向人端粒酶逆轉錄酶基因的amiRNA序列；（2）通過熒光定量、Western-Blot、Telochaser、細胞增殖、遷移、凋亡、血管生成、移植瘤實驗來分析amiRNA的沉默效應和抗腫瘤活性；（3）借助報告基因沉默實驗和基因芯片技術分析amiRNA的特異性和安全性；（4）依據miRNA引導序列的長度、指紋圖譜、自由能等特征值差... 

【文章來源】：華僑大學福建省

【文章頁數】：123 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

RNAi通路簡圖

在胞內的內源性表達[42]。之后不久，Chung 等人發(fā)現以鼠 miR-155 原始轉錄本（pri-mmu-miR-155）為小 RNA 表達框的小 RNA 表達載體同樣可以實現目的小RNA 的長效、安全、可控的表達[43]。鑒于這兩種載體在安全性和可控性方面優(yōu)于第一代小 RNA 表達載體，人們將以內源 miRNA 原始轉錄本為小 RNA 表達框的小 RNA 表達載體稱為 amiRNA 載體，又稱為第二代小 RNA 表達載體。以 pri-hsa-miR-30a 和 pri-mmu-miR-155 為小 RNA 表達框的 amiRNA 載體是目前已被廣泛認可且商品化的兩種 amiRNA 載體，雖然在安全性上實現了對第一代小 RNA 表達載體的突破，但對目的 siRNA 的表達卻不夠高效[5-7]。后續(xù)也有學者嘗試進行以其它內源 miRNA 原始轉錄本為小 RNA 表達框的 amiRNA 載體研究，但其表達效率未能實現對這兩種商品化 amiRNA 載體的超越[7, 44-48]。由于表達不夠高效，人們不得不通過加大劑量來彌補自身表達的不足，這必然導致高劑量帶來的潛在副作用和成本問題[49]。研究表明，現有 amiRNA 載體表達不高效的主要原因是 amiRNA 載體中所采用的表達框不能高效地加工出目的小 RNA[8]。

1.2.2 腺相關病毒RNAi 載體化表達中形成的 shRNA 載體或 amiRNA 載體同樣需要借助一定的投遞介質才能進入細胞內，常用的介質有化學型介質和病毒型介質兩種。病毒型載體具有轉染效率高、宿主范圍廣、時效長等優(yōu)點，是小 RNA 載體化表達和基因治療的主流運載工具，占基因治療臨床試驗的 72.4-82.0%（圖 1.3）。目前已經很多基因藥物進入臨床試驗，但卻只有一個獲得批準，其原因除了跟選擇的基因有關外，跟使用的載體也密切相關。載體本身的安全性也是阻礙其成功上市的重要原因，如腺病毒的自主復制能力、逆轉錄病毒的基因整合能力等都會給基因治療帶來潛在的威脅。而其中的腺相關病毒（Adenoassociated virus,AAV）由于具有良好的安全性，日益受到人們的重視。第一個基因藥物 Glybera的誕生除了其治療基因的有效性外，還有一個重要原因就是其所使用 AAV 這個基 因 載 體 的 安 全 性 。（http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/002145/smops/Positive/human_smop_000235.jsp&mid=WC0b01ac058001d127）。


本文編號：3389756