本文關鍵詞：TRPC1在fMLP誘導嗜中性粒細胞定向移動中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 人嗜中性粒細胞在血液中占白細胞總數(shù)的60%-70%,是機體先天免疫應答的重要組成部分,處于機體抵御外來微生物病原體,特別是化膿性細菌入侵的第一道防線。定向移動是真核細胞的基本生物生理學特征,包括極性化和趨化兩部分。細胞極性(cell polarity)對正常細胞尤其是人嗜中性粒細胞的遷移,細胞質分裂以及細胞分化等生物學過程起到關鍵性的作用。目前所說的細胞極性是指細胞為了行使某些特殊的生理功能或產(chǎn)生定向的分化,位于胞內的信號分子產(chǎn)生不對稱分布致使細胞在形狀上產(chǎn)生不對稱性,具體表現(xiàn)為胞內蛋白質和脂質等信號物質不對稱分布,細胞骨架、胞內其他物質發(fā)生重構。極性細胞外形特征是形成寬大的頭部即是偽足,狹窄的尾部稱為尾足。細胞趨化(Cell chemotaxis)是指細胞感受到內外源趨化物質,并且能順著趨化物質濃度梯度到達趨化物質所在的部位,從而發(fā)揮生物生理學作用。所以,定向移動是中性粒細胞基本的功能。 中性粒細胞具有較強的定向遷移能力,一旦感知趨化物質的存在,細胞便能迅速形成以頭部寬大,尾部狹窄為特征的極性形態(tài),到達趨化物質存在的地方,發(fā)揮殺菌抗炎作用。盡管中性粒細胞生理功能如此重要,但中性粒細胞發(fā)揮定向遷移(趨化),殺菌抗炎作用的前提是依賴于極性的形成。定向遷移的基礎是細胞發(fā)生極性化,在極性化的基礎上進行趨化。但在中性粒細胞建立并維持極性形態(tài)的過程中,任何信號分子的調控失敗都會導致其生理功能異常。臨床上一些疾病如哮喘、敗血癥、缺血再灌注損傷、類風濕性關節(jié)炎、過敏反應及一些由于感染引起的器官衰竭反應等都與中性粒細胞極性功能增強或減弱導致的定向移動異常密切相關。因此,研究調控中性粒細胞極性化和趨化性形成的分子機制,對防止和治療中性粒細胞功能異常導致的機體組織損傷具有重大的藥理和臨床意義。 近年來,研究細胞胞內游離鈣濃度(cytosolic free Ca2+concentration[Ca2+]i)和分布的變化參與中性粒細胞多種功能的調節(jié),如極性化趨化等已成為熱點。已有文獻報道人中性粒細胞由于缺乏電壓門控鈣通道(voltage-gated calcium channels, VGCC),細胞的外鈣內流主要由內質網(wǎng)鈣庫清空引起質膜上的鈣通道開放導致外鈣內流,這就是所謂的鈣庫操縱鈣離子通道(store-operated Ca2+entry, SOCE)。目前除了STIM1和Orial蛋白是組成SOCE的兩種必需蛋白分子,大部分學者認為SOCE另一個重要的候選分子是瞬時受體電位通道(transient receptor potential channel,TRP)中C家族成員TRPC1(TRP-canonical1)分子。TRP被認為可能是鈣庫操縱性鈣通道的分子基礎,原因可能是它與胞內鈣離子濃度變化密切相關而且可能被其激活,TRPC是TRP家族的主要成員之一,在哺乳動物體內有非常廣泛的表達,TRPC包括7個亞型,TRPC1-7,各亞型的分布與功能有所差別。其中TRPC1分布很廣,在骨骼肌、腎臟、腦、皮膚、肺、前列腺、心臟、睪丸和卵巢里都有高水平表達。在哺乳動物中最早被發(fā)現(xiàn)的TRP通道是TRPC1,其公認的作用是鈣依賴的分泌、收縮和參與受體介導。TRPC1通常和包括PLC和IP3受體等蛋白組成信號復合物參與細胞信號轉導,這種復合物的功能通過在胞膜的特定脂質環(huán)境上組裝得到實現(xiàn)。作為SOCE重要的候選分子,TRPC1蛋白是細胞膜上非選擇性鈣通道,目前對TRPC1在極性化以及趨化過程中的作用研究很少,尤其是從膜電流角度去分析TRPC1的作用就更少。因此,利用膜片鉗技術從電生理學的角度去研究TRPC1在中性粒細胞極性化以及趨化過程中的作用,探討中性粒細胞極定向移動過程中TRPC1是否參與,在這個過程中起什么作用,如果TRPC1參與定向移動,那么如何調控細胞膜電流來達到定向移動的。目前對這方面的研究不多,本課題所開展的實驗就是為了回答這些問題,為研究中性粒細胞定向移動提供電生理學理論依據(jù)。 目前已經(jīng)證實中性粒細胞能夠被大量的趨化物包括內源的趨化物激活,如白細胞介素8(interleukin8,IL-8)、血小板激活因子(pallet acticated factor, PAF)、補體成分C5a (complement component factor5a)和外源的趨化物質激活,如甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine, fMLP)等。當中性粒細胞感知到趨化物fMLP, fMLP刺激細胞內質網(wǎng)鈣庫釋放鈣離子,細胞迅速朝趨化物濃度高的方向建立起一個頭寬尾窄的極性形態(tài),細胞骨架結構重構,促進極性的形成。細胞受到趨化物刺激形成極性,在這過程中細胞迅速啟動胞內一系列復雜的極性信號機制,但是目前對這機制還不十分清楚,就極性過程中TRPC1如何調控極性細胞膜電流尚未見報道。本研究就是在外源趨化劑fMLP誘導人嗜中性粒細胞極性化的背景下去探討TRPC1是否參與定向移動,如何調控細胞膜電流,對極性化、趨化過程中膜電流的影響。 目的 本實驗通過使用均一、低濃度的外源趨化劑fMLP作用于人嗜中性粒細胞,建立細胞極性模型。應用TRPC1蛋白抗體、阻斷劑(GsMTx-4)封閉和阻斷TRPC1蛋白通道,進而通過膜片鉗技術記錄中性粒細胞膜電容、各種處理因素TRPC1相關膜電流的變化,比較相應的電流密度,以及通過Zigmond chamber觀察上述試劑對中性粒細胞極性趨化性的影響,利用Transwell小室觀察TRPC1抗體、阻斷劑(GsMTx-4)對嗜中性粒細胞遷移的影響,探討TRPC1是否參與中性粒細胞極性化、趨化過程以及TRPC1在其中起什么作用,對膜電流有什么影響。 方法 1.采用經(jīng)典的密度梯度離心法急性分離人嗜中性粒細胞,主要包括Dextran沉降,標準的梯度密度離心和低滲裂解殘存紅細胞三個步驟。首先使用葡聚糖T-500(Dextran-T500)沉降紅細胞,接著淋巴細胞分離液密度梯度離心,最后殘存紅細胞再裂解。獲得的中性粒細胞進行瑞氏-吉姆薩染色和臺盼藍染色,分析中性粒細胞的純度、活性。 2.采用5步法拉制有芯微電極,并進行拋光處理,使用膜片鉗相應儀器檢測電極電阻。 3.采用膜片鉗相關儀器進行中性粒細胞封接和破膜,記錄膜電容和各種處理因素后TRPC1相關電流的變化。 4.在外源趨化劑fMLP存在的情況下,使用Zigmond chamber觀察細胞受到TRPC1抗體作用的形態(tài)學變化。 5.通過Transwell小室實驗檢測中性粒細胞的定向遷移率的變化。 結果 1.5步拉制并經(jīng)拋光處理的微電極電阻為5-7MΩ。 2.人嗜中性粒細胞膜電容(Cm)為14.58pF。 3. TRPC1抗體、GsMTx-4均能引起中性粒細胞膜電流的下降,與對照組或/和fMLP組比較,電流密度變化均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4.TRPC1抗體能降低fMLP誘導的嗜中性粒細胞極性率。 5. TRPC1抗體、GsMTx-4均能導致人嗜中性粒細胞趨化能力的降低。 結論 1. TRPC1抗體和GsMTx-4均能降低fMLP誘導的中性粒細胞極性化膜電流,具有阻斷細胞膜電流,進而抑制細胞定向移動的作用。 2. TRPC1介導膜電流的變化,參與中性粒細胞定向移動,如果受到抑制,細胞定向趨化能力降低。
【關鍵詞】：人嗜中性粒細胞 極性化 TRPCC1 定向移動 膜電流
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 材料和方法20-36
• 1 實驗材料20-26
• 2 實驗方法26-34
• 3 數(shù)據(jù)處理34-36
• 結果36-65
• 1 TRPC1抗體對fMLP誘導的中性粒細胞定向遷移的影響36-55
• 2 GsMTx-4對fMLP誘導的中性粒細胞定向移動的影響55-65
• 討論65-74
• 全文小結74-75
• 參考文獻75-83
• 英文縮略詞表83-86
• 碩士期間主要成果86-87
• 致謝87-88

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 鄒珍友;黃艷;王勇;張慧;戴威;許露露;程彥偉;汪素美;;趨化劑對細胞偽足極性生長的影響研究[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2009年01期

2 羅瓊;蔡春青;謝翠華;楚心唯;武清宜;孟曉靜;鄒飛;;全血中性粒細胞分離方法對fMLP誘導極性化的影響[J];南方醫(yī)科大學學報;2010年07期

3 韓重陽;王曉良;;瞬時受體電位通道研究進展[J];生理科學進展;2008年01期

4 袁春華;蔡春青;鄒飛;;4℃預處理對人中性粒細胞膜電流和極性的影響[J];生理學報;2006年05期

5 武清宜;蔡春青;謝翠華;袁春華;孟曉靜;;嗜中性粒細胞在均勻濃度fMLP誘導極性化過程中偽足長度的變化[J];中國細胞生物學學報;2010年04期

  本文關鍵詞：TRPC1在fMLP誘導嗜中性粒細胞定向移動中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：335813