本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用特異性免疫磁珠快速檢測(cè)單增李斯特菌，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：研制單增李斯特菌特異性免疫磁珠，結(jié)合免疫磁珠富集技術(shù)與選擇性平板培養(yǎng)法，初步建立免疫磁珠-選擇性平板快速檢測(cè)方案，對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行分離及鑒定。同時(shí)，利用免疫磁珠富集技術(shù)進(jìn)行樣品前處理，聯(lián)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，建立一種快速檢測(cè)單增李斯特菌的新方法。 方法：利用分泌單增李斯特菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞（1B10A7），制備并純化腹水型單抗；選擇三種表面官能團(tuán)不同的磁珠制備特異性免疫磁珠；通過(guò)比較免疫磁珠捕菌率高低挑選合適磁珠，建立免疫磁珠-選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)方法；通過(guò)特異性分析、靈敏度分析及牛奶樣品檢測(cè)評(píng)價(jià)該方法的檢測(cè)效果。隨后，以單增李斯特菌毒力基因hly和prfA為模板設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，經(jīng)陽(yáng)性篩選、交叉菌篩選及熒光定量PCR挑選最佳引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)分子克隆后測(cè)序鑒定；建立免疫磁珠-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，通過(guò)靈敏度分析和牛奶樣品檢測(cè)對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果：制備了效價(jià)為6×10~4的腹水型單抗，單抗偶聯(lián)磁珠后，選擇捕菌率最佳的Dynal甲苯磺�；罨胖檫M(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；特異性免疫磁珠聯(lián)合選擇性平板法可檢出濃度為103CFU/mL及以上的單增李斯特菌，僅與英諾克李斯特菌存在交叉反應(yīng)；牛奶樣品單次僅需6h增菌能被檢出，較常規(guī)增菌時(shí)間縮短42h；檢測(cè)限為0.7CFU/mL。經(jīng)篩選獲得一組prfA基因高特異性且擴(kuò)增效率最高的引物對(duì)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定與靶序列吻合；免疫磁珠-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度為10~1CFU/mL，對(duì)牛奶樣品的檢測(cè)限為1CFU/mL。 結(jié)論：聯(lián)合使用免疫磁珠富集技術(shù)與選擇性培養(yǎng)基，能在30h內(nèi)完成對(duì)牛奶樣品的檢測(cè)，較國(guó)標(biāo)法減少42h以上，且具有同等的靈敏度。免疫磁珠-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法具有高特異性、高靈敏度及快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，在不進(jìn)行預(yù)增菌的情況下對(duì)含菌量較低的陽(yáng)性樣品亦可檢出。本研究結(jié)合免疫磁珠富集技術(shù)，初步建立了單增李斯特菌快速檢測(cè)方法，通過(guò)進(jìn)一步的條件摸索及優(yōu)化，日后有望應(yīng)用到食品安全監(jiān)測(cè)工作中。
【關(guān)鍵詞】：免疫磁珠 富集 單克隆抗體 單增李斯特菌 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 檢測(cè)限
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R446.6;R378.994
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 前言8-21
• 1 免疫磁珠分離技術(shù)8-11
• 1.1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu)8-9
• 1.2 免疫磁珠富集作用原理9
• 1.3 免疫磁珠富集優(yōu)勢(shì)9-11
• 1.4 免疫磁珠富集技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用11
• 2 單增李斯特菌的概述11-14
• 2.1 單增李斯特菌的生物學(xué)特征及血清型分類11-12
• 2.2 單增李斯特菌的致病機(jī)理及毒力因子12-13
• 2.3 單增李斯特菌的危害13-14
• 3 單增李斯特菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展14-16
• 3.1 傳統(tǒng)分離及生化鑒定14-15
• 3.2 免疫學(xué)檢測(cè)15
• 3.3 分子生物學(xué)診斷15-16
• 4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)16-19
• 4.1 LAMP 技術(shù)擴(kuò)增原理及步驟16-17
• 4.2 LAMP 技術(shù)特點(diǎn)17-19
• 5 本研究的目的和意義19-20
• 6 技術(shù)路線圖20-21
• 第二章 單增李斯特菌 IMB-顯色培養(yǎng)基檢測(cè)方法研究21-37
• 1 材料21-25
• 1.1 主要試劑和儀器設(shè)備21-22
• 1.2 菌株22
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22
• 1.4 主要溶液的配制方法22-25
• 2 試驗(yàn)方法25-29
• 2.1 菌株的培養(yǎng)及滅活處理25
• 2.2 單增李斯特菌腹水型單抗的制備及純化25-27
• 2.3 單增李斯特菌免疫磁珠的制備27-28
• 2.4 IMB-選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)方法的建立28-29
• 2.5 IMB-選擇性培養(yǎng)基法檢測(cè)人工污染牛奶樣品29
• 3 結(jié)果與分析29-34
• 3.1 單增李斯特菌單抗的純化及鑒定29-31
• 3.2 單增李斯特菌免疫磁珠的制備31-32
• 3.3 IMB-選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)方法的建立32-33
• 3.4 IMB-選擇性培養(yǎng)基法檢測(cè)人工污染牛奶樣品33-34
• 4 討論34-37
• 第三章 單增李斯特菌 IMB-LAMP 檢測(cè)方法研究37-51
• 1 材料37-39
• 1.1 主要試劑和儀器設(shè)備37-38
• 1.2 菌株38
• 1.3 主要溶液的配制方法38-39
• 2 試驗(yàn)方法39-44
• 2.1 菌株的培養(yǎng)39
• 2.2 細(xì)菌 DNA 的提取39-40
• 2.3 單增李斯特菌特異性 LAMP 引物的設(shè)計(jì)40-43
• 2.4 IMB-LAMP 方法的建立43
• 2.5 IMB-LAMP 方法檢測(cè)牛奶樣品43-44
• 3 結(jié)果與分析44-49
• 3.1 單增李斯特菌特異性 LAMP 引物的篩選及鑒定44-47
• 3.2 免疫磁珠捕菌率的鑒定47
• 3.3 IMB-LAMP 靈敏度的測(cè)定47-48
• 3.4 IMB-LAMP 方法檢測(cè)人工污染牛奶樣品48-49
• 4 討論49-51
• 第四章 結(jié)論與展望51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 在校期間發(fā)表論文和學(xué)術(shù)交流情況58-60
• 致謝60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 徐金亭;李志清;向軍儉;唐勇;楊紅宇;;單增李斯特菌免疫磁珠的制備研究[J];食品工業(yè)科技;2012年05期

2 張加林;楊林嫻;;單增李斯特菌的食源性污染狀況及檢測(cè)方法[J];醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐;2012年08期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張亞爽;LAMP和PCR檢測(cè)單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

2 李志清;單增李斯特菌特異性的膜表面蛋白的抗體的制備[D];暨南大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用特異性免疫磁珠快速檢測(cè)單增李斯特菌，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：323709