發(fā)布時間：2017-04-22 21:08

  本文關(guān)鍵詞：Slit2蛋白對TNF-α誘導的大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞增殖遷移的影響及其機制探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1984年，Nusslein-Volhard等[1]在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了分泌型細胞外基質(zhì)蛋白Slit，分子量約為200kD，Slit家族在哺乳動物體內(nèi)有3種亞型：Slit1、Slit2、Slit3，其中Slit1只存在于神經(jīng)系統(tǒng)[2],而Slit2、Slit3還可表達在神經(jīng)系統(tǒng)外,如肺、腎、肝臟、乳腺、心臟，視網(wǎng)膜等[3,4,5,6]。Slit的主要結(jié)構(gòu)包括N端串聯(lián)的4個富含亮氨酸的重復區(qū)（leucine-rich repeats/LRRs,D1-D4），7-9個表皮生長因子重復序列（EGF repeats），1個層粘連蛋白G-樣區(qū)域(laminin G-like domain)和1個C末端的半胱氨酸結(jié)（cystein knot）[7]。Slit的表皮生長因子區(qū)域能水解釋放出一個長的Slit-N端和一個短的Slit-C端，其中Slit-N端有活性，能調(diào)節(jié)其與單通道跨膜受體Robo的結(jié)合，而Slit-C端無生物學活性[8]。 已證實在神經(jīng)系統(tǒng)Slit-Robo能阻止縱向神經(jīng)元進入中線，在下丘腦-垂體-性腺軸形成上也有作用[9]；在炎癥反應中，Slit-Robo能阻止趨化因子CXCL12/CXCR4介導的T細胞和巨噬細胞趨化[10]；在腫瘤組織中，能通過影響細胞周期影響腫瘤組織的生長，將Slit2蛋白注入裸鼠體內(nèi)，抗凋亡因子Bcl-xl和增值相關(guān)周期蛋白Cdk6、Cyclin D1降低[11]，肝癌細胞增殖率降低[12]；在心血管系統(tǒng)中，Slit-Robo影響心肌細胞遷移，降低上皮鈣粘連蛋白的活性，從而影響早期心臟管腔形成及血管重建[13,14]。近年來LIU等發(fā)現(xiàn)外源性Slit2蛋白對血管平滑肌細胞（vascular smooth musclecells，VSMCs）的生長沒有明顯作用，但能以濃度依賴的方式通過影響RAC1蛋白（Rho家族的GTP酶，Rho GTP ases）的活性阻止血小板源性生長因子（Platelet Derived Growth Factor，PDGF）介導的人主動脈VSMCs遷移[4]。在Slit家族中，Slit2是研究最多的一個亞型。Morlot等發(fā)現(xiàn)Slit2D4（第四亮氨酸重復區(qū)）能利用保守基序在其凹面形成二聚體，同時能與硫酸乙酰肝素結(jié)合[15]，增強Slit2第二亮氨酸重復區(qū)與Robo的結(jié)合。Slit2-Robo1被證明是白細胞趨化的內(nèi)源性抑制因子，在炎癥反應中能抑制中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞的遷移[16,17]。將Slit2蛋白通過尾靜脈注射至AopE-/-（載脂蛋白E缺失）小鼠，血清中HDL升高，動脈斑塊面積縮小，提示Slit2蛋白的過表達可能抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[18]。 腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis FactorAlpha,TNF-α）是一種重要的炎癥介質(zhì)，可促進平滑肌細胞增生及遷移，參與冠狀動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。在人惡性黑色素瘤細胞（A375），TNF-α能上調(diào)Slit2mRNA的表達[19]。因此我們篩選Slit2作為研究對象，觀察在TNF-α作用下，Slit2-Robo對VSMCs增殖及遷移的影響。目前國內(nèi)外關(guān)于TNF-α與Slit2-Robo信號通路的研究尚未見報道，我們通過體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞，檢測Slit2在平滑肌細胞上的表達和在TNF-α刺激下的表達及分泌情況，觀察Slit2-Robo信號通路對平滑肌細胞增殖及遷移的影響，探討其可能的作用機制，為今后研究Slit-Robo信號通路在動脈粥樣硬化中的作用提供實驗依據(jù)。 目的：1.檢測大鼠胸主動脈VSMCs上Slit2mRNA及Slit2蛋白的表達。2.了解炎癥因子TNF-α對VSMCs增殖遷移的作用及其對Slit2蛋白表達的影響。3.觀察Slit2-Robo信號通路對VSMCs增殖遷移的影響，探討其可能的作用機制。 方法：1.貼壁法培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs。2.免疫熒光技術(shù)檢測平滑肌細胞Slit2蛋白的表達，RT-PCR檢測Slit2mRNA的表達[20]。3.大鼠VSMCs分為正常對照組和實驗組，正常對照組：無添加TNF-α的細胞懸液；實驗組分別含有TNF-α（0.01、0.1、1、10、100ng/ml）各5個不同濃度的細胞懸液組。CCK-8及Transwell實驗檢測各組細胞懸液對大鼠VSMCs增殖及遷移的影響；real-time PCR技術(shù)檢測各組細胞Slit2mRNA的表達，ELISA技術(shù)檢測培養(yǎng)液中Slit2蛋白的分泌。4.大鼠VSMCs分為正常對照組及試驗組，正常對照組：無添加Slit2的細胞懸液；實驗組：分別含有Slit2蛋白(50、75、100、125、150ng/ml)各5個不同濃度的細胞懸液。CCK-8及transwell實驗檢測及兩組細胞懸液對VSMCs增殖遷移的影響。5.大鼠VSMCs分為正常對照組、陽性對照組及試驗組，正常對照組：無添加Slit2和TNF-α的細胞懸液；陽性對照組：含10ng/ml TNF-α的細胞懸液；實驗組：分別含10ng/ml TNF-α及Slit2蛋白(50、75、100、125、150ng/ml）各5個不同濃度的細胞懸液。CCK-8及transwell實驗檢測各組細胞懸液對大鼠VSMCs增殖遷移的影響。6.大鼠VSMCs分為正常對照組：無添加Slit2蛋白及TNF-α的細胞懸液；TNF-α組：含濃度10ng/ml TNF-α的細胞懸液；Slit2組：含濃度100ng/ml Slit2的細胞懸液；TNF-α+Slit2組：含10ng/ml TNF-α+100ng/ml Slit2的細胞懸液。Werstern Blot及real-time PCR檢測各組RAC1蛋白及基因的表達。 結(jié)果：1.從培養(yǎng)的VSMCs提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增出Slit2mRNA，Slit2免疫熒光染色顯示VSMCs胞質(zhì)呈陽性。2.增殖實驗中試驗組與對照組相比，OD值升高，差異有統(tǒng)計學意義P0.05），TNF-α濃度10ng/ml時作用最明顯；遷移試驗中TNF-α濃度1、10、100ng/ml組與正常對照組遷移細胞數(shù)目比較差異有統(tǒng)計學意義P0.05）,TNF-α濃度10ng/ml時作用最明顯，，而TNF-α濃度0.01，0.1ng/ml組與正常對照組遷移細胞數(shù)目比較差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。Real-time PCR顯示實驗組與正常對照組相比，Slit2mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；同時ELISA顯示OD值升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，1ng/mlTNF-α導致的Slit2mRNA和Slit2蛋白水平達頂峰。3. Slit2對VSMCs增殖遷移的影響：實驗組與對照組OD值及遷移細胞數(shù)目比較差異均無統(tǒng)計學意義（P0.05）。4. Slit2對TNF-α誘導的VSMCs增殖遷移的影響：實驗組、陽性對照組、正常對照組三組之間細胞遷移數(shù)目比較有統(tǒng)計學意義（P0.05）；CCK-8結(jié)果顯示實驗組、陽性對照組與正常對照組OD值比較差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），而實驗組與陽性對照組OD值比較差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。5. RAC1蛋白的檢測：TNF-α組、TNF-α+Slit2組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TNF-α組與TNF-α+Slit2組比較有顯著差異（P0.01），而Slit2組與正常對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 結(jié)論：1.培養(yǎng)的大鼠VSMCs上有Slit2蛋白表達。2. TNF-α能促進VSMCs的增殖及遷移。3. TNF-α刺激大鼠VSMCs后Slit2mRNA的表達上調(diào)，Slit2蛋白的分泌增加，濃度為1ng/ml TNF-α刺激VSMCs后Slit2蛋白的分泌水平達峰值。4. Slit2蛋白可抑制濃度10ng/ml TNF-α誘導的VSMCs遷移，但對VSMCs的增殖無明顯作用。5.濃度10ng/ml的TNF-α促進RAC1的表達，濃度100ng/ml的Slit2可抑制濃度10ng/mlTNF-α誘導的RAC1表達。
【關(guān)鍵詞】：腫瘤壞死因子-α Slit2 RAC1 血管平滑肌細胞 增殖 遷移
【學位授予單位】：川北醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-10
• Abstract10-17
• 第一部分 大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞培養(yǎng)及 SLIT2 蛋白的檢測17-32
• 摘要17-18
• Abstract18-19
• 材料與方法19-27
• 結(jié)果27-28
• 討論28-30
• 附圖30-32
• 第二部分 TNF-α對血管平滑肌細胞增殖遷移及 SLIT2 表達的影響32-44
• 摘要32-33
• Abstract33-34
• 實驗材料與方法34-38
• 結(jié)果38-39
• 討論39-41
• 附圖41-44
• 第三部分 SLIT2 對 TNF-α誘導的血管平滑肌細胞增殖遷移的影響44-54
• 摘要44-45
• Abstract45-47
• 實驗材料與方法47-48
• 結(jié)果48-49
• 討論49-51
• 附圖51-54
• 第四部分 SLIT2 抑制 TNF-α誘導的血管平滑肌細胞遷移的機制探討54-68
• 摘要54-55
• Abstract55-56
• 材料與方法56-62
• 結(jié)果62-63
• 討論63-66
• 附圖66-68
• 結(jié)論68-69
• 參考文獻69-74
• 綜述：SLIT-ROBO 信號傳導通路與平滑肌細胞遷移的研究進展74-85
• 參考文獻82-85
• 附錄85-86
• 個人簡歷86

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王雙,雷小勇;尼群地平對豬主動脈平滑肌細胞增殖的影響[J];衡陽醫(yī)學院學報;1999年01期

2 方正旭 ,王伶,劉東;關(guān)于動脈平滑肌細胞培養(yǎng)的幾個問題[J];江西醫(yī)學院學報;2002年05期

3 梁萍,孫雷,唐建武,王

本文編號：321249