本文關鍵詞：人臍帶間充質干細胞誘導為脂肪細胞的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的：間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一類較原始的干細胞,具有高度增殖性和多向分化潛能。目前研究較多的是骨髓間充質干細胞,而臍帶間充質干細胞近幾年才被人們重視并加以研究。與骨髓間充質干細胞相比,臍帶間充質干細胞不僅具有相似的增殖特性及多向分化潛能,而且具有取材方便、來源廣泛、免疫原性更低等優(yōu)勢,這是其成為近年來干細胞研究領域中的熱點。本研究建立了分離純化人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell, hUC-MSC)的方法,并對其表面標志進行了鑒定。同時研究間充質干細胞向脂肪細胞的誘導分化,并探討其分化過程中miRNA-27a和miRNA-143的表達,為闡述間充質干細胞脂向分化的調控機制提供了新的思路,并有一定的臨床應用價值。 研究方法：在嚴格無菌條件下,采集健康足月胎兒的臍帶組織,采用酶消化法和組織塊貼壁法進行原代細胞分離培養(yǎng),通過流式細胞儀對其表面標記進行檢測。將原代細胞進行傳代培養(yǎng),并將第5代間充質干細胞經IBMX、胰島素、吲哚美辛和地塞米松聯(lián)合使用進行脂向誘導。利用油紅O免疫組化染色的方法鑒定分化后的細胞,使用實時熒光定量PCR技術比較間充質干細胞和脂肪細胞中miRNA-27a和miRNA-143以及它們靶基因的表達。隨后分析miRNA-27a和miRNA-143以及它們對應靶基因的變化趨勢。 研究結果：分離純化后的hUC-MSCs呈均勻有序的成纖維細胞形態(tài)。臍帶酶消化法培養(yǎng)的細胞2-3天可見成纖維樣細胞,3-5天后在倒置顯微鏡下可見散在分布的細胞集落,貼壁后的細胞增殖速度較快,原代細胞培養(yǎng)5天后可見大量細胞,融合度達80%。使用組織塊培養(yǎng)法,5-7天可見臍帶組織塊周圍有細胞爬出,爬出的細胞隨后貼壁生長,呈短粗梭型或多角形。貼壁后的細胞增殖速度快,2周左右細胞可達80-90%融合。兩種方法下,當細胞達到80-90%的融合度時,按1：3的比例進行傳代,傳代后細胞生長3-6小時便可貼壁,最初為短粗的梭形或者卵圓形,24小時后細胞變?yōu)殚L梭形或多邊形,細胞均勻分布,平行排列生長或旋渦狀生長,約3天可達到80%融合。取第5代臍帶間充質干細胞進行流式細胞術檢測細胞表面標記物,結果顯示hUC-MSCs高表達CD44、CD73、 CD105、CD166、HLA-ABC,不表達cD34、CD106,符合間充質干細胞的生物學特性。在將其定向誘導為脂肪細胞的過程中,利用吲哚美辛、地塞米松、胰島素以及3-異丁基-1-甲基黃嘌呤四種誘導劑可以使臍帶間充質干細胞分化為脂肪細胞的效率達到90%以上,且絕大多數為油紅O染色陽性的成熟脂肪細胞。利用實時熒光定量PCR檢測證實miRNA-27a在MSCs脂向分化的過程中顯著下調(0.0095±0.002vs1±0.03)；miRNA-143的相對表達量則顯著上調(17.81±0.88vs1±0.004)。 結論：該研究證實采用酶消化法和組織塊法均能分離得到人臍帶間充質干細胞,且均具有高度的增殖能力,流式細胞儀檢測符合間充質干細胞的生物學特性。在體外利用吲哚美辛、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤四種誘導劑可以使臍帶間充質干細胞分化為脂肪細胞。在誘導分化過程中,miRNA-27a和miRNA-143的相對表達量發(fā)生變化,提示miRNA-27a和miRNA-143可能參與MSCs的脂向分化過程。本研究為促進脂肪組織工程的發(fā)展及軟組織損傷修復與重建的臨床應用,以及為肥胖、糖尿病等代謝性疾病的診斷和治療帶來了全新的思路和視角。
【關鍵詞】：臍帶間充質干細胞 脂向分化 脂肪細胞 miRNA 實時熒光定量 PCR
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-14
• 研究現(xiàn)狀、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、臍帶間充質干細胞分離、培養(yǎng)和純化14-23
• 1.1 對象和方法14-17
• 1.1.1 對象14
• 1.1.2 主要儀器和設備14
• 1.1.3 主要試劑及配置14-15
• 1.1.4 UC-MSCs的分離培養(yǎng)15-16
• 1.1.5 UC-MSCs的體外擴增16
• 1.1.6 形態(tài)學觀察16-17
• 1.1.7 流式細胞儀檢測UC-MSCs的表面標志17
• 1.2 結果17-21
• 1.2.1 UC-MSCs形態(tài)學及生長特點17
• 1.2.2 UC-MSCs流式細胞儀檢測17-21
• 1.3 討論21-22
• 1.3.1 臍帶間充質干細胞的分離培養(yǎng)21-22
• 1.3.2 臍帶間充質干細胞的鑒定22
• 1.4 小結22-23
• 二、臍帶間充質干細胞定向誘導為脂肪細胞23-33
• 2.1 對象和方法23-26
• 2.1.1 主要儀器和設備23
• 2.1.2 主要試劑及配置23
• 2.1.3 UC-MSCs誘導為脂肪細胞23-24
• 2.1.4 油紅O染色24
• 2.1.5 細胞RNA提取24
• 2.1.6 qRT-PCR檢測脂肪細胞中miRNA的表達24-26
• 2.2 結果26-30
• 2.2.1 成脂誘導及油紅O染色26
• 2.2.2 miR-27a與靶基因PPARγ在誘導分化的脂肪細胞中的表達變化26-27
• 2.2.3 miR-143與靶基因ERK5在誘導分化的脂肪細胞中的表達變化27-30
• 2.3 討論30-31
• 2.3.1 UC-MSCs誘導為脂肪細胞30
• 2.3.2 miRNA與脂肪細胞30-31
• 2.4 小結31-33
• 結論33-34
• 參考文獻34-36
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明36-37
• 綜述37-51
• 綜述參考文獻46-51
• 致謝51

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：人臍帶間充質干細胞誘導為脂肪細胞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：320496