本文關(guān)鍵詞：擬除蟲菊酯噬菌體抗體庫構(gòu)建及基因工程抗體制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抗體作為免疫分析的核心試劑,其制備技術(shù)一直是制約免疫分析法在農(nóng)藥殘留分析中應用的瓶頸因素,因此尋求一種新的抗體制備方法對農(nóng)殘免疫分析具有重要的意義。 本研究利用噬菌體抗體庫技術(shù)和基因工程技術(shù),制備了擬除蟲菊酯單鏈抗體,并對抗體的結(jié)構(gòu)特點及其與抗原的特異性作用進行了分析。首先,從分泌擬除蟲菊酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株2G2E7中提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,利用兼并引物進行PCR擴增,獲得了長度約350bp的重鏈可變區(qū)基因和約325bp的輕鏈可變區(qū)基因,再經(jīng)重疊延伸PCR獲得了750bp左右的單鏈抗體(scFv)基因。經(jīng)過內(nèi)切酶SfiⅠ和NotⅠ對scFv和pCANTAB5E載體進行酶切、連接和熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1,最終獲得了庫容大小2.3×107的擬除蟲菊酯初級抗體庫,陽性率為100%。利用抗原對抗體庫進行淘選,通過五輪淘選,有效地富集了擬除蟲菊酯特異性噬菌體抗體,第五輪淘選后的噬菌體陽性率為95%；隨機挑取五輪淘選后的單克隆進行測序,得到3個scFv基因。將3個基因進行PCR擴增、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后,與pET-26b載體進行連接,成功構(gòu)建重組表達載體scFv-pET26b。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株BL21,最終得到3個scFv-pET26b重組表達菌株。對表達條件進行優(yōu)化,經(jīng)超聲破碎及SDS-PAGE檢測,結(jié)果顯示在0.1mM IPTG,200rpm,25℃低溫誘導12h條件下,3個scFv蛋白能成功表達,重組蛋白主要以包涵體的形式存在于細胞內(nèi),少量以可溶形式存在。利用間接競爭ELISA初步鑒定3個scFv的活性,結(jié)果表明：擬除蟲菊酯2號單鏈抗體(PBAscFv2)對氰戊菊酯具有一定的結(jié)合活性,10μg/mL標品濃度下抑制率約為20%。序列分析結(jié)果顯示PBAscFv2蛋白共245個氨基酸,重鏈123個氨基酸,輕鏈107個氨基酸,柔性連接肽15個氨基酸；經(jīng)SOPMA軟件分析,PBAscFv2二級結(jié)構(gòu)中含α螺旋21處,p折疊109處,p轉(zhuǎn)角23處,隨機卷曲92處；利用CPH models3.2Server對PBAscFv2的空間結(jié)構(gòu)進行模擬,并利用Discovery Studio2.5軟件將PBAscFv2與氰戊菊酯分子進行對接,結(jié)果顯示抗原抗體結(jié)合區(qū)域由三部分構(gòu)成：①抗體重鏈高可變區(qū)CDR3區(qū)(VH-CDR3)殘基Met106、Asp107、Tyr108和Trp109；②輕鏈框架Ⅲ區(qū)(VL-FR3)殘基Thr91和Ser92；③輕鏈高可變區(qū)CDR2區(qū)(VL-CDR2)殘基Ala41、Ser42和Pro43。 本研究的開展為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥基因工程抗體的制備、及其在ELISA檢測方法中的應用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：擬除蟲菊酯 噬菌體抗體庫 單鏈抗體 重組表達 間接競爭酶聯(lián)免疫分析
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-22
• 1.1 農(nóng)藥殘留概述9-11
• 1.1.1 我國農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀9
• 1.1.2 農(nóng)藥殘留的危害9-11
• 1.2 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥11-12
• 1.2.1 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥簡介11
• 1.2.2 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的危害11-12
• 1.3 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測方法12-15
• 1.3.1 分光光度法12
• 1.3.2 色譜法12-14
• 1.3.3 免疫分析法14-15
• 1.4 基因工程抗體15-18
• 1.4.1 基因工程抗體簡介15-16
• 1.4.2 常見的幾種基因工程抗體16-18
• 1.5 噬菌體抗體庫技術(shù)18-20
• 1.5.1 噬菌體展示技術(shù)原理18-19
• 1.5.2 噬菌體抗體庫的種類19-20
• 1.5.3 噬菌體抗體庫應用現(xiàn)狀20
• 1.6 研究目的及意義20-21
• 1.7 研究內(nèi)容21-22
• 2 材料和方法22-44
• 2.1 材料22-28
• 2.1.1 實驗用菌種及細胞22
• 2.1.2 實驗用工具酶及抗生素22
• 2.1.3 實驗用試劑及試劑盒22-24
• 2.1.4 實驗儀器24-25
• 2.1.5 PCR所用的引物25-26
• 2.1.6 主要溶液和培養(yǎng)基的配置方法26-28
• 2.2 實驗方法28-44
• 2.2.1 擬除蟲菊酯單克隆細胞總RNA的提取28-29
• 2.2.2 擬除蟲菊酯單鏈抗體基因的擴增29-33
• 2.2.3 噬菌體展示初級庫的構(gòu)建33-36
• 2.2.4 淘選36-38
• 2.2.5 噬菌體ELISA38
• 2.2.6 菌落PCR驗證38-39
• 2.2.7 測序39
• 2.2.8 利用pCANTAB5E-PBAscFv-HB2151菌株表達單鏈抗體39-40
• 2.2.9 pET26b-PBAscFv-JM109菌株的制備40-42
• 2.2.10 利用pET26b-PBAscFv-BL21菌株表達單鏈抗體42-43
• 2.2.11 利用間接競爭ELISA初步鑒定單鏈抗體活性43
• 2.2.12 單鏈抗體一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)分析43-44
• 3 結(jié)果與討論44-61
• 3.1 實驗結(jié)果44-60
• 3.1.1 擬除蟲菊酯單克隆細胞總RNA的提取44
• 3.1.2 擬除蟲菊酯單鏈抗體基因的擴增44-46
• 3.1.3 噬菌體展示初級庫的構(gòu)建46-47
• 3.1.4 淘選47-48
• 3.1.5 噬菌體ELISA48
• 3.1.6 菌落PCR驗證48
• 3.1.7 序列分析48-50
• 3.1.8 利用pCANTAB5E-PBAscFv-HB2151菌株表達單鏈抗體50-51
• 3.1.9 pET26b-PBAscFv-JM109菌株的制備51-54
• 3.1.10 利用pET26b-PBAscFv-BL21菌株表達單鏈抗體54-56
• 3.1.11 利用間接競爭ELISA初步鑒定單鏈抗體活性56-57
• 3.1.12 單鏈抗體一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)分析57-60
• 3.2 討論60-61
• 4 結(jié)論61-62
• 5 展望62-63
• 6 參考文獻63-70
• 7 致謝70

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：擬除蟲菊酯噬菌體抗體庫構(gòu)建及基因工程抗體制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：314248