目的:（1）構(gòu)建人表皮生長(zhǎng)因子受體（HER2/neu）胞外區(qū)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA6-HER2/neu）;轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞（EMT6）,獲得其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株（EMT6/HER2/neu）。（2）構(gòu)建HER2neu、IL12融合基因重組核酸疫苗pcDNA6-HER2/neu-IL12。（3）將該疫苗在HER2/neu陽(yáng)性乳腺癌小鼠體內(nèi)應(yīng)用,探討其預(yù)防和治療作用。方法:（1）HER2/neu重組質(zhì)粒的構(gòu)建:用PCR從含HER2/neu全長(zhǎng)基因的pcDNA3.1-HER2/neu質(zhì)粒上擴(kuò)增HER2/neu胞外區(qū)（ECD）基因片段;經(jīng)酶切、連接構(gòu)建pcDNA6-HER2/neu,通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定;（2）建立HER2/neu陽(yáng)性小鼠乳腺癌細(xì)胞株（EMT6/HER2/neu）:以PEI法將pcDNA6-HER2/neu導(dǎo)入小鼠乳腺癌細(xì)胞（EMT6）中,經(jīng)殺稻瘟菌素（Blasticidin）篩選,獲得抗性克隆EMT6/HER2/neu;用RT-PCR檢測(cè)EMT6/HER2/neu中HER2/neu mRNA,免疫組化法檢測(cè)其HER2/neu蛋白的表達(dá)。（3）pcDNA6-HER2/neu... 

【文章來(lái)源】：青島大學(xué)山東省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

菌液PCR鑒定HERZ/neu結(jié)果

再以含維持量的 Blasticidin(終濃度為Zm留L)培養(yǎng)液進(jìn)行克隆擴(kuò)增，得到EMT6/HER2/neu(實(shí)驗(yàn)組)和EMT6/PcDNA6(對(duì)照組)兩種細(xì)胞株。而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的正常EMT6細(xì)胞在上述篩選壓力下4天內(nèi)死亡脫落。如圖2.4。圖2.4轉(zhuǎn)染PcDNA6一HEFZ/neu細(xì)胞與正常EMT6細(xì)胞加篩選壓力后的生長(zhǎng)狀態(tài)A:EMT6壓 [ERZ/neu單克隆;B:正常EMT6 2.2.1RT·PCR測(cè)定 HERZ/neumRNA的表達(dá)按 TRIzolRNA提取試劑盒提取細(xì)胞mRNA，經(jīng)Rl’ -PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示，EMT6沮ERZ/neu細(xì)胞的mRNA最終擴(kuò)增出大小約為1896bp的片段，而未轉(zhuǎn)染的EMTh細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的EMT6/PcDNA6細(xì)胞均未見(jiàn)此條帶，如圖2.5。l4

圖2.3pcDNA6-HEFZ/neu雙酶切鑒定結(jié)果RZ加eu對(duì)照;2一8:HERZ/neuPCR陣汁險(xiǎn)克隆;9:DLKaRa公司測(cè)序，結(jié)果顯示PcDNA6一HERZ/ne確。ERZ/neu轉(zhuǎn)染EMT6細(xì)胞及陽(yáng)性克隆Blastic記in(終濃度為10m留L)持續(xù)篩選10天后Blasticidin(終濃度為Zm留L)培養(yǎng)液進(jìn)行克隆擴(kuò)和EMT6/PcDNA6(對(duì)照組)兩種細(xì)胞株。而壓力下4天內(nèi)死亡脫落。如圖2.4。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]重組HER2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EMT6細(xì)胞株的篩選[J]. 徐騰飛,張文卿,于紅,李丹.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2009(03)
[2]重組腺病毒載體mIL-12治療小鼠黑色素瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 張建華,趙德礦,王青青,沈芬平,翁躍頌.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2007(06)
[3]混合性熱休克蛋白/肽疫苗與白細(xì)胞介素-12聯(lián)合誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 宋舸,袁玫,崔雪梅,眭翔,趙斌,盧世璧.  中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐. 2007(03)
[4]人IL-12重組質(zhì)粒對(duì)S-180荷瘤小鼠的治療作用[J]. 孫運(yùn)芳,張文卿,王麗娜,于紅,李丹.  中華腫瘤防治雜志. 2007(05)
[5]用細(xì)胞因子流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)體外檢測(cè)重組人IL-12的生物學(xué)活性[J]. 張文卿,王麗娜,劉志軍,Dernard Mariameb,于紅,楊忠思,于修平.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2006(04)
[6]HER-2/neu基因在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展[J]. 孫文欣.  國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè)). 2005(01)
[7]Combined gene therapy of endostatin and interleukin 12 with polyvinylpyrrolidone induces a potent antitumor effect on hepatoma[J]. Pei-Yuan Li Ju-Sheng Lin Zuo-Hua Feng Yu-Fei He He-Jun Zhou Xin Ma Xiao-Kun Cai De-An Tian Institute of Liver Diseases,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,Hubei Province,ChinaDepartment of Biochemistry and Molecular Biology,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,Hubei Province,China.  World Journal of Gastroenterology. 2004(15)
[8]HER-2neu胞外區(qū)基因疫苗的免疫避孕作用[J]. 倪晶,倪翼,張瑞華,熊思東.  中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2004(04)
[9]HER2/neu動(dòng)物模型的建立和免疫學(xué)鑒定[J]. 方路,吳玉章.  第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2003(13)
[10]HER-2/neu胞外配體結(jié)合區(qū)基因的克隆及原核表達(dá)[J]. 徐明,郭寧,馮健男,施明,胡美茹,沈倍奮.  免疫學(xué)雜志. 2003(03)



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