本文關(guān)鍵詞：anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)及其鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：anisomycin作為一種蛋白合成抑制劑可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生凋亡，此前本課題組已發(fā)現(xiàn)anisomycin能抑制人類急性T淋巴細(xì)胞性白血病(Jurkat T)細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，JNK信號(hào)通路的活化與anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡有關(guān)，miRNA let-7c可能參與JNK信號(hào)通路的活化介導(dǎo)JurkatT細(xì)胞凋亡，顯示其應(yīng)用于T淋巴細(xì)胞性白血病臨床治療的潛在可能性。因此，探明anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡的機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞存在諸多與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，在anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡過程中究竟有哪些細(xì)胞凋亡相關(guān)基因參與？它們是否與JNK/miRNAlet-7c關(guān)聯(lián)？本研究利用qPCR基因芯片技術(shù)首次比較系統(tǒng)地分析了anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的的差異性表達(dá)譜，以期進(jìn)一步闡明anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。 目的：通過qPCR基因芯片技術(shù)篩選anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)譜，確證差異表達(dá)基因E2F2是否與anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡有關(guān)，E2F2分子與介導(dǎo)anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡的miRNA let-7c之間是否存在關(guān)聯(lián)。 方法：鏡下觀察不同濃度anisomycin處理組Jurkat T細(xì)胞形成集落的大小和數(shù)量；熒光顯微鏡下觀察不同濃度anisomycin處理后Jurkat T細(xì)胞核染色質(zhì)形態(tài)的變化；流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度anisomycin作用下Jurkat T細(xì)胞的凋亡率；qPCR基因芯片從88種細(xì)胞凋亡相關(guān)基因中篩選anisomycin作用后差異表達(dá)顯著的13個(gè)基因；RT-PCR和qPCR在mRNA水平驗(yàn)證篩選出顯著差異表達(dá)的基因，從中選出感興趣的E2F2以確定其作用。轉(zhuǎn)染miRNA let-7c模擬物和miRNAlet-7c抑制劑至Jurkat T細(xì)胞中，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，qPCR和WesternBlot分別在基因和蛋白水平檢測miRNA let-7c和E2F2的含量變化以證實(shí)miRNAlet-7c和E2F2與Jurkat T細(xì)胞凋亡是否有關(guān)；轉(zhuǎn)染E2F2siRNA至Jurkat T細(xì)胞中，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，qPCR和Western Blot分別在基因水平和蛋白水平檢測let-7c和E2F2的含量變化以進(jìn)一步確證E2F2與miRNA let-7c介導(dǎo)anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡是否關(guān)聯(lián)。* 結(jié)果：隨著anisomycin濃度的升高，Jurkat T細(xì)胞集落變小和數(shù)量減少；JurkatT細(xì)胞核皺縮，凋亡小體形成，凋亡細(xì)胞百分比與anisomycin的濃度成依賴性遞增。qPCR基因芯片分析顯示，anisomycin處理Jurkat T細(xì)胞1h后，AIFM2、CAS5、CD226、CD27、CIDEA、DAPK2、EGFR、ERBB3、FADD、FASLG、IFNA2、IFNB1、IGF1、IGF1R、IKBKG、IL10、IL1A、IL1B、IL6R、IL7、MAP3K1、MAP3K10、 MAP3K14、 NTRK1、 PDCD1、 PPP3CC、 STAT1、 STAT5B和TNFRSF10A共29個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，AKT2、AKT3、CAS4、CD24、E2F2、EndoG、IKBKB、IL4、MAP3K5、PIK3R2、TNF和TNFRSF10B共12個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，，其中，CD226、FADD和IL1B上調(diào)高達(dá)20~45倍，AKT2、CD24、E2F2、EndoG、IL4和PIK3R2基因下調(diào)10~20倍。anisomycin處理Jurkat T細(xì)胞6h后，APAF1、API5、CAS7、CAS9、CD226、CD27、E2F2、ERBB3、IFNB1、IGF1R、IL2、RIPK1、STAT1、TNFRSF10A和XIAP15個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，DAPK3、FASLG、IKBKG、IL6R和IRAK15個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，其中，CAS7、CAS9、CD226、IL2和TNFRSF10A5個(gè)基因上調(diào)達(dá)10~20倍，而FASLG和IL6R下調(diào)均達(dá)15倍左右。篩選出差異倍數(shù)10倍以上的13個(gè)基因，即CD226、CD24、E2F2、FASLG、TNFRSF10A、CAS7、CAS9、PIK3R2、IKBKB、AKT2、AKT3、FADD和EndoG，qPCR顯示E2F2、PIK3R2、IKBKB、CD24、CAS9、CD226和TNFRSF10A7基因的qPCR結(jié)果與芯片的結(jié)果一致。miRNA let-7c可以促進(jìn)Jurkat T細(xì)胞的凋亡，qPCR和Western Blot顯示miRNAlet-7c增加E2F2的水平；敲低E2F2基因可以抑制細(xì)胞凋亡，并一定程度促進(jìn)let-7c的基因表達(dá)。 結(jié)論：anisomycin能誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞明顯凋亡，可能與E2F2、PIK3R2、CD24、IKBKB、CAS9、CD226和TNFRSF10A有關(guān)；E2F2在anisomycin誘導(dǎo)Jukat T細(xì)胞凋亡過程中與miRNA let-7c相關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：anisomycin 基因芯片 篩選 E2F2 miRNA let-7c 凋亡 Jurkat T
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 前言11-29
• 1 腫瘤的發(fā)生機(jī)制11-13
• 1.1 細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)與腫瘤發(fā)生的關(guān)系11-12
• 1.2 細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生的關(guān)系12-13
• 1.3 自噬與腫瘤發(fā)生的關(guān)系13
• 2 細(xì)胞凋亡機(jī)制13-17
• 2.1 細(xì)胞表面凋亡受體 Fas 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡14-15
• 2.2 線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡15-16
• 2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)因子16-17
• 3 anisomycin 的抗腫瘤作用17-18
• 4 qPCR 基因芯片技術(shù)18-19
• 5 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因19-27
• 5.1 CD22619-20
• 5.2 CD2420
• 5.3 E2F220-21
• 5.4 TNFRSF10A21-22
• 5.5 Endonuclease G22
• 5.6 AKT 家族22-23
• 5.7 Caspase 家族23-24
• 5.8 FADD24-25
• 5.9 FASLG25-26
• 5.10 IKBKB26
• 5.11 PIK3R226-27
• 6 研究思路與目的27-29
• 材料與方法29-50
• 1 細(xì)胞株29
• 2 試劑29-31
• 3 主要儀器31-32
• 4 主要溶液的配制32-35
• 5 細(xì)胞培養(yǎng)35
• 6 集落的觀察35
• 7 Hoechst 染色35-36
• 8 Annexin V / PI 雙染色36
• 9 PCR Array36-42
• 9.1 提取細(xì)胞總 RNA36-37
• 9.2 RNA 樣品的完整性、濃度和純度的檢測37
• 9.3 逆轉(zhuǎn)錄37-38
• 9.4 PCR Array 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測38-39
• 9.5 RT-PCR39-42
• 9.5.1 細(xì)胞總 RNA 的提取39
• 9.5.2 RT39-40
• 9.5.3 PCR40-42
• 9.6 實(shí)時(shí)定量 PCR42
• 10 Western Blot42-44
• 10.1 細(xì)胞胞漿蛋白的提取42-43
• 10.2 電泳43
• 10.3 轉(zhuǎn)膜43
• 10.4 封閉、抗體結(jié)合與顯色43-44
• 11 miRNA let-7c 的應(yīng)用44-47
• 11.1 細(xì)胞處理及轉(zhuǎn)染44-45
• 11.2 Annexin V/PI 雙染色45
• 11.3 qPCR45
• 11.4 Western Blot45-46
• 11.5 ELISA46-47
• 12 E2F2 siRNA 的應(yīng)用47-49
• 12.1 細(xì)胞處理及轉(zhuǎn)染47
• 12.2 Annexin V/PI 雙染色47-48
• 12.3 qPCR48
• 12.4 Western Blot48-49
• 12.4.1 細(xì)胞內(nèi)核蛋白的提取48-49
• 12.5 ELISA49
• 13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析49-50
• 結(jié)果50-72
• 1 anisomycin 抑制 Jurat T 細(xì)胞集落形成的影響50
• 2 anisomycin 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞核邊集的影響50-51
• 3 anisomycin 誘導(dǎo) Jurkat T 細(xì)胞凋亡51-52
• 4 anisomycin 誘導(dǎo) Jurkat T 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因差異表達(dá)的篩選52-57
• 5 anisomycin 誘導(dǎo) Jurkat T 細(xì)胞凋亡基因差異表達(dá)的鑒定57-62
• 6 miRNA let-7c 在 anisomycin 誘導(dǎo) Jurkat T 細(xì)胞凋亡中的作用62
• 7 miRNA let-7c 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞內(nèi) E2F2 的影響62-66
• 7.1 miRNA let-7c 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞 E2F2 mRNA 水平的影響62-65
• 7.2 miRNA let-7c 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞 E2F2 蛋白水平的影響65-66
• 8 miRNA let-7c 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響66-67
• 9 E2F2 siRNA 在 anisomycin 誘導(dǎo) Jurkat T 細(xì)胞凋亡中的作用67-69
• 9.1 E2F2 siRNA 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞 E2F2 蛋白水平的影響67
• 9.2 E2F2 siRNA 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞凋亡的影響67-69
• 10 E2F2 siRNA 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞內(nèi) miRNA let-7c 的影響69-71
• 10.1 Jurkat T 細(xì)胞中 miRNA let-7c 在基因水平的半定量變化69
• 10.2 E2F2 siRNA 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞 miRNA let-7c mRNA 的定量影響69-71
• 11 anisomycin 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響71-72
• 討論72-78
• 1 凋亡相關(guān)基因差異表達(dá)譜的分析72-74
• 2 miRNA let-7c 在 anisomycin 誘導(dǎo) Jurkat T 細(xì)胞凋亡中的作用74-75
• 3 E2F2 在 anisomycin 誘導(dǎo) Jurkat T 細(xì)胞凋亡中的作用75-76
• 4 miRNA let-7c 與 E2F2 之間存在的可能關(guān)系76-78
• 小結(jié)78-79
• 參考文獻(xiàn)79-86
• 發(fā)表論文86-87
• 致謝87-88
• 英文縮略詞表88

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Daniele Baiz;Barbara Dapas;Rossella Farra;Bruna Scaggiante;Gabriele Pozzato;Fabrizio Zanconati;Nicola Fiotti;Lara Consoloni;Sara Chiaretti;Gabriele Grassi;;Bortezomib effect on E2F and cyclin family members in human hepatocellular carcinoma cell lines[J];World Journal of Gastroenterology;2014年03期

  本文關(guān)鍵詞：anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)及其鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：311000