本文關(guān)鍵詞：陰溝腸桿菌噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是腸桿菌科革蘭陰性桿菌，廣泛分布于自然界，亦可存在于人和動物腸道中。陰溝腸桿菌是臨床感染常見的致病菌，可引起敗血癥、呼吸道感染、尿道感染和腹膜炎等疾病。近年來，由于陰溝腸桿菌對β-內(nèi)酰胺酶類、喹諾酮類及氨基糖苷類抗生素均出現(xiàn)較高耐藥率，使得治療該細(xì)菌感染面臨難題。 噬菌體是一類可以侵襲細(xì)菌的病毒，廣泛分布于自然界中，，對其宿主菌具有高度的特異性和高效裂解性，有望成為新型的抗菌制劑。雖然噬菌體的研究開展已久，但國內(nèi)外尚未見有關(guān)陰溝腸桿菌噬菌體的深入研究報道。 本研究以陰溝腸桿菌為宿主菌，從居民區(qū)污水中分離獲得4株陰溝腸桿菌噬菌體，通過噬斑法反復(fù)純化，篩選出1株裂解性強(qiáng)的毒性噬菌體，命名為ФEc53，并對其進(jìn)行了生物學(xué)特性的研究及抗感染應(yīng)用的初步研究。 噬菌體ФEc53的生物學(xué)特性 經(jīng)3~5次反復(fù)純化后，在雙層瓊脂上可形成直徑約為2～4mm的圓形、透明、邊界清晰的噬菌斑。電子顯微鏡下，該噬菌體頭部呈球形，直徑約60nm，有一長尾約130nm。根據(jù)噬菌體的新分類法，ФEc53屬于有尾病毒目、管尾噬菌體科（Caudovirales，Siphovirida）。對ФEc53提取核酸后進(jìn)行脈沖場電泳及瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明：該噬菌體的基因組大小為37.7kb左右，含EcoRⅠ、EcoRⅤ、BamHⅠ和NdeⅠ的多個酶切位點(diǎn)。通過SDS-PAGE對噬菌體蛋白進(jìn)行分析表明，噬菌體顆粒至少含有8種衣殼蛋白，其中相對分子量為22kD的蛋白條帶含量較大，表明這種蛋白在噬菌體病毒顆粒中所占比例較高，可能為主要衣殼蛋白。 將噬菌體與宿主菌按照一定比例（分別為MOI=0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001）進(jìn)行混合，37℃振蕩培養(yǎng)，每隔12min取出測定細(xì)菌濃度，確定最佳感染復(fù)數(shù)為0.01。選取最佳感染復(fù)數(shù)進(jìn)行一步生長曲線的測定及繪制，噬菌體ФEc53感染宿主菌的潛伏期約為5min，根據(jù)爆發(fā)量=噬菌體爆發(fā)末期的噬菌體滴度/感染初期細(xì)菌的濃度的公式計算，爆發(fā)量為6.06×10~3PFU/cell，在50min時到達(dá)平臺期。 通過超濾的濃縮方法可提高噬菌體滴度，并降低內(nèi)毒素含量。經(jīng)宿主特異性及裂解范圍實(shí)驗(yàn)表明，該噬菌體有高度的特異性，僅能裂解1株陰溝腸桿菌，為窄譜噬菌體。經(jīng)過7個月的保存實(shí)驗(yàn)證明：保存于4℃和-70℃中的噬菌體的滴度并未發(fā)生明顯變化。 噬菌體對皮下膿腫感染動物模型的治療實(shí)驗(yàn) 建立家兔皮下膿腫感染模型，皮下注射陰溝腸桿菌53后，立即在相同部位皮下注射ФEc53，觀察并記錄膿腫情況，測定膿腫部位、肝臟及脾臟內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量及噬菌體滴度。結(jié)果表明，噬菌體治療組膿腫面積隨時間推移逐漸減小，膿腫內(nèi)部細(xì)菌量有所下降的同時噬菌體量有所升高。 本實(shí)驗(yàn)初步研究了ФEc53的生物學(xué)特性及其抗感染治療，為今后噬菌體的深入研究提供一些依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：陰溝腸桿菌 噬菌體 生物學(xué)特性 噬菌體治療
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 文獻(xiàn)回顧11-19
• 1.1 噬菌體的結(jié)構(gòu)、抗菌機(jī)制及特點(diǎn)11-13
• 1.1.1 噬菌體的結(jié)構(gòu)11
• 1.1.2 噬菌體的抗菌機(jī)制11-13
• 1.1.3 噬菌體的抗菌特點(diǎn)13
• 1.2 噬菌體的發(fā)現(xiàn)及初期研究13-14
• 1.3 二戰(zhàn)后東歐噬菌體研究發(fā)展14-15
• 1.4 西歐及美國地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌的噬菌體研究進(jìn)展15-17
• 1.4.1 大腸埃希菌噬菌體研究15-16
• 1.4.2 銅綠假單胞菌噬菌體研究16
• 1.4.3 其他腸道桿菌噬菌體的情況16-17
• 1.5 噬菌體研究的發(fā)展趨勢17-19
• 1.5.1 噬菌體基因結(jié)構(gòu)的改造17
• 1.5.2 噬菌體基因編碼產(chǎn)物的開發(fā)與應(yīng)用17-19
• 第2章 陰溝腸桿菌噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究19-39
• 2.1 材料與方法19-28
• 2.1.1 材料19-21
• 2.1.2 方法21-28
• 2.2 結(jié)果28-36
• 2.2.1 陰溝腸桿菌的 16S rRNA 鑒定28-29
• 2.2.2 陰溝腸桿菌噬菌體的分離及純化29
• 2.2.3 噬菌體的電鏡觀察29-30
• 2.2.4 噬菌體的核酸提取及酶切分析30-31
• 2.2.5 噬菌體蛋白的 SDS-PAGE 凝膠電泳31-33
• 2.2.6 最佳感染復(fù)數(shù)的測定33
• 2.2.7 一步生長曲線的繪制33-34
• 2.2.8 噬菌體的濃縮及內(nèi)毒素的去除34
• 2.2.9 噬菌體的保存34-35
• 2.2.10 宿主菌的特異性判定和裂解譜實(shí)驗(yàn)35-36
• 2.3 討論36-39
• 第3章 陰溝腸桿菌噬菌體抗感染的初步應(yīng)用39-47
• 3.1 材料39-40
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株39
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)用噬菌體39
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)動物39-40
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)器材40
• 3.2 方法40-42
• 3.2.1 制備菌懸液及測定菌液濃度40
• 3.2.2 制備噬菌體懸液及測定其滴度40
• 3.2.3 家兔皮下膿腫模型的建立40-41
• 3.2.4 噬菌體治療41-42
• 3.3 結(jié)果42-44
• 3.3.1 家兔皮下膿腫生長情況42-43
• 3.3.2 各組織內(nèi)細(xì)菌濃度的測定43
• 3.3.3 各組織內(nèi)噬菌體滴度的測定43-44
• 3.4 討論44-47
• 第4章 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 作者簡介54-55
• 在學(xué)期間取得的科研成果55-56
• 致謝56

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：陰溝腸桿菌噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：307968