本文關(guān)鍵詞：白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197蛋白在白喉?xiàng)U菌中表達(dá)及純化體系的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：國內(nèi)研制的結(jié)合疫苗的載體蛋白大多采用白喉毒素、破傷風(fēng)類毒素、白喉無毒突變體CRM197蛋白,但由于白喉毒素、破傷風(fēng)類毒素、均需要經(jīng)甲醛脫毒處理得到,制備時(shí)需要對大量的毒素上清液進(jìn)行處理,花費(fèi)時(shí)間較長,而且脫毒后的類毒素存在毒性逆轉(zhuǎn)的可能。CRM197蛋白是一種白喉毒素?zé)o毒突變體,不具有白喉毒素毒性,但具有良好的免疫原性和安全性,作為載體蛋白在國內(nèi)外中應(yīng)用廣泛。本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù)在白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium diphtheriae ATCC 27010)中對CRM197蛋白進(jìn)行了表達(dá),并對發(fā)酵,純化工藝進(jìn)行研究。在白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium diphtheriae ATCC 27010)中構(gòu)建表達(dá)CRM197蛋白的重組質(zhì)粒。在pK18mob-SacB載體上插入廣譜復(fù)制起點(diǎn),從而得到能夠在白喉?xiàng)U菌和大腸桿菌中穿梭復(fù)制的表達(dá)載體pCKM4.1;將完整的CRM197蛋白的表達(dá)基因插入此空載體pCKM4.1,得到游離于白喉?xiàng)U菌染色體基因組外的穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)載體pCKM5.1,并通過接合轉(zhuǎn)移的方法將其成功轉(zhuǎn)化至白喉?xiàng)U菌中以構(gòu)建成基因工程菌株。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析在58.0 kDa處可見清晰條帶,Western blotting分析可見特異條帶。對得到的基因工程菌株進(jìn)行生產(chǎn)工藝摸索。通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化至白喉?xiàng)U菌(ATCC27010)中,載體上的導(dǎo)肽序列可以使得CRM197蛋白作為可溶性蛋白分泌到胞外表達(dá),CRM197蛋白可占到菌體總蛋白的70%。同時(shí)加強(qiáng)對鐵的調(diào)控,進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件以提高產(chǎn)量。經(jīng)過Q膜、硫酸銨沉淀、陰離子交換純化步驟獲得純度達(dá)到95%的CRM197蛋白樣品,大大的提高了蛋白得率,節(jié)約了純化時(shí)間和成本。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)合疫苗 CRM197 接合轉(zhuǎn)移 鐵調(diào)控 陰離子柱
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-15
• 1.1 結(jié)合疫苗概述9-11
• 1.1.1 結(jié)合疫苗產(chǎn)生9-10
• 1.1.2 結(jié)合疫苗的免疫機(jī)制10
• 1.1.3 結(jié)合疫苗的前景及存在問題10-11
• 1.2 結(jié)合疫苗中的常用載體11-12
• 1.2.1 結(jié)合疫苗中的常用載體概況11
• 1.2.2 結(jié)合疫苗中的常用載體分類11-12
• 1.3 CRM197蛋白作為蛋白載體在結(jié)合疫苗中的應(yīng)用12-13
• 1.3.1 CRM197蛋白的分子生物學(xué)基礎(chǔ)12
• 1.3.2 CRM197蛋白的應(yīng)用及生產(chǎn)工藝開發(fā)12-13
• 1.4 本課題的研究目的、意義和主要內(nèi)容13-15
• 1.4.1 本論文研究的目的和意義13-14
• 1.4.2 本論文研究的主要內(nèi)容14-15
• 2 材料與方法15-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-22
• 2.1.1 菌種及質(zhì)粒15
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器15-16
• 2.1.3 工具酶及相關(guān)試劑16-17
• 2.1.4 培養(yǎng)基的配制及培養(yǎng)條件17-19
• 2.1.5 主要溶液19-22
• 2.2 主要分析方法22-25
• 2.2.1 核酸電泳方法22
• 2.2.2 DNA膠回收過程22
• 2.2.3 質(zhì)粒小提試劑盒提取細(xì)菌質(zhì)粒22-23
• 2.2.4 常規(guī)DNA PCR23
• 2.2.5 常用SDS-PAGE配制方法23-25
• 2.2.6 Western Blot免疫印跡25
• 2.2.7 層析柱裝柱處理25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法25-39
• 2.3.1 表達(dá)CRM197蛋白的基因工程菌株構(gòu)建25-31
• 2.3.2 表達(dá)CRM197蛋白的基因工程菌株搖瓶水平上蛋白表達(dá)31-33
• 2.3.3 表達(dá)CRM197蛋白的基因工程菌株2L發(fā)酵罐水平上蛋白表達(dá)33
• 2.3.4 表達(dá)CRM197蛋白的基因工程菌株的發(fā)酵工藝33-35
• 2.3.5 CRM197蛋白的純化工藝35-38
• 2.3.6 Western Blot對純化后的CRM197蛋白定性研究38-39
• 3 結(jié)果與討論39-55
• 3.1 表達(dá)CRM197蛋白的基因工程菌株構(gòu)建39-43
• 3.1.1 表達(dá)CRM197蛋白的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建39-42
• 3.1.2 質(zhì)粒pCKM5.1的電轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移42-43
• 3.1.3 質(zhì)粒pCKM5.1中表達(dá)CRM197基因片段測序43
• 3.1.4 質(zhì)粒pCKM5.1穩(wěn)定性檢測43
• 3.2 表達(dá)CRM197蛋白的基因工程菌株發(fā)酵工藝的摸索43-47
• 3.2.1 表達(dá)CRM197蛋白的基因工程菌株在搖瓶水平上蛋白表達(dá)量的鑒定43-44
• 3.2.2 表達(dá)CRM197蛋白的基因工程菌株在2L發(fā)酵罐水平上蛋白表達(dá)量的鑒定44-45
• 3.2.3 不同濃度Fe~(3+)對表達(dá)CRM197蛋白的基因工程菌株生長的影響45-46
• 3.2.4 氨基酸儲液流加補(bǔ)料對表達(dá)CRM197蛋白基因工程菌株生長的影響46-47
• 3.3 CRM197蛋白純化工藝的研究47-54
• 3.3.1 硫酸銨沉淀法粗純CRM197蛋白不同濃度的選擇47-48
• 3.3.2 Q SFF層析純化工藝的摸索48-49
• 3.3.3 柱層析色譜法純化CRM197蛋白不同填料的選擇49-51
• 3.3.4 DEAE柱層析色譜法純化CRM197蛋白條件優(yōu)化51-52
• 3.3.5 CRM197蛋白純化工藝總結(jié)52-54
• 3.4 表達(dá)CRM197蛋白的基因工程菌株發(fā)酵純化后產(chǎn)物性質(zhì)檢測54-55
• 3.4.1 表達(dá)CRM197基因工程菌株的純化產(chǎn)物Western Blot的定性研究54-55
• 4 結(jié)論55-56
• 5 展望56-57
• 6 參考文獻(xiàn)57-64
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況64-65
• 8 致謝65-67
• 附錄67-74

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 章躍陵;羅蕓;彭宣憲;;血藍(lán)蛋白功能研究新進(jìn)展[J];海洋科學(xué);2007年02期

2 歐陽晶,王健偉,屈建國,洪濤;白喉毒素DT_(386)片段的表達(dá)純化及細(xì)胞毒性研究[J];中國生物工程雜志;2004年06期

  本文關(guān)鍵詞：白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197蛋白在白喉?xiàng)U菌中表達(dá)及純化體系的構(gòu)建，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：305644