目的:建立三丁基氯化錫（TBTC）誘導(dǎo)的新生雌性大鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡模型,并探討相關(guān)機制。方法:取新生24 h以內(nèi)的雌性SD大鼠,分離下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞進行原代培養(yǎng)。免疫熒光染色法鑒定下丘腦神經(jīng)元純度后,分別暴露于含不同濃度TBTC（0、100、150、200、250、300μg/L）的培養(yǎng)基中。孵育24 h后,CCK-8檢測各組細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況,Hoechst 33258染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài),透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白JNK、p-JNK的表達。結(jié)果:免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元純度約為92.23%。與TBTC 0μg/L組相比,各濃度TBTC干預(yù)24 h對下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞的生長均有抑制作用,其相對存活率均顯著降低（P<0.01）,且呈濃度依賴性;與TBTC 0μg/L組相比,不同濃度的TBTC作用24 h后,下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡,其細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.01）,且呈濃度依賴性。Hoechst 33258染色顯示,TBTC 150μg/L組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞核呈致密濃染的高強度藍色熒... 

【文章來源】：上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報. 2019,33(04)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

免疫熒光染色鑒定下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞(×200)2．2TBTC對下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響與

上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報第33卷第4期2019年7月GFAP標(biāo)記的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞呈紅色熒光;490nm藍色光激發(fā)β-tubulinⅢ標(biāo)記的胞漿和突觸呈綠色熒光;390nm紫外光激發(fā)DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍色熒光;后兩者融合即為神經(jīng)元細(xì)胞。見圖1。免疫染色的細(xì)胞形態(tài)與熒光倒置顯微鏡下觀察一致。隨機選取10個視野計數(shù)，測得神經(jīng)元純度約為92．23%。圖1免疫熒光染色鑒定下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞(×200)2．2TBTC對下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響與TBTC0μg/L組比較，各濃度TBTC干預(yù)24h對下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞的生長均有抑制作用，其相對存活率均顯著降低(P＜0．01)，且呈濃度依賴性。其中，150μg/LTBTC作用24h，下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞增殖抑制率為(44．7±4．5)%。見圖2。2．3TBTC對下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響與TBTC0μg/L組比較，不同濃度的TBTC作用24h后，下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡，其細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P＜0．01)，且呈濃度依賴性。其中，150μg/LTBTC作用24h，下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率為(42．6±6．6)%。綜合細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的實驗結(jié)果，選取TBTC150μg/L作為誘與TBTC0μg/L組比較，＊＊P＜0．01圖2TBTC各濃度組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞存活率(n=6，x－±s)導(dǎo)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡模型的藥物濃度進行后續(xù)實驗。見圖3、圖4。圖3TBTC各濃度組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況·75·

AcademicJournalofShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicineVol．33No．4Jul．2019與TBTC0μg/L組比較，＊＊P＜0．01圖4TBTC各濃度組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率(n=3，x－±s)Hoechst33258染色后，TBTC0μg/L組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻分布的低強度藍色熒光。與TBTC0μg/L組相比，TBTC150μg/L組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞呈致密濃染的高強度藍色熒光，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮態(tài)和顆粒狀改變，可見明顯的凋亡形態(tài)。見圖5。2．4TBTC對下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響透射電鏡觀察顯示，TBTC0μg/L組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞圖5TBTC0μg/L及150μg/L組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)(Hoechst33258染色，×500)膜飽滿，雙層核膜完整，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布;TBTC150μg/L組細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離，細(xì)胞核固縮并發(fā)生裂解，染色質(zhì)邊集化呈“新月狀”，細(xì)胞膜內(nèi)陷或出芽形成小泡，將細(xì)胞分割成多個有膜包繞的凋亡小體。見圖6。2．5TBTC對下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞JNK表達的影響與TBTC0μg/L組相比，TBTC150μg/L組p-JNK蛋白表達顯著增多，p-JNK/JNK蛋白表達比值顯著上調(diào)(P＜0．01)。見圖7。圖6TBTC0μg/L及150μg/L組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)(透射電鏡)與TBTC0μg/L組比較，＊＊P＜0．01圖7TBTC0μg/L及150μg/L組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞JNK表達(n=3，x－±s)·85·

【參考文獻】：
期刊論文
[1]中藥調(diào)更湯改善圍絕經(jīng)期綜合征患者陰陽失衡狀態(tài)89例臨床觀察[J]. 桑珍,徐蓮薇.  江蘇中醫(yī)藥. 2006(07)
[2]Effects of Zuogui Wan on neurocyte apoptosis and down-regulation of TGF-β1 expression in nuclei of arcuate hypothalamus of monosodium glutamate-liver regeneration rats[J]. Han-Min Li Xiang Gao Mu-Lan Yang Jia-Jun Mei Liu-Tong Zhang Xing-Fan Qiu Hepatopathy Institute,Affiliated Hospital of Hubei Traditional Chinese Medicine College,Wuhan 430061,Hubei Province,ChinaUltramicropathology Laboratory,Tongji Medicine College,Huazhong Scientific University,Wuhan 430030,Hubei Province,ChinaHubei Traditional Chinese Medicine College,Wuhan 430061,Hubei Province,China.  World Journal of Gastroenterology. 2004(19)
[3]從肝腎論治更年期綜合征45例[J]. 徐蓮薇,孫卓君.  上海中醫(yī)藥雜志. 2003(10)



本文編號：2959136