對乙型肝炎病毒（HBV）野生株及核殼蛋白變異株L97和V60在HepG₂細胞HLA-I表面表達的特性及其調節(jié)機制進行初步探討，試圖認識病毒及其變異與宿主細胞相互作用和影響。 構建HBV基因組野生株和核殼蛋白變異株穩(wěn)定表達載體，提供實驗研究的基礎材料。通過定點突變技術將1.2拷貝HBV（adr亞型）野生株質粒p3.8Ⅱ構建成核殼蛋白變異株L97和V60質粒，經序列測定證實nt2189A→C和nt2078C→G。3株質粒轉染HepG₂細胞DNA的Southern blot雜交均顯示明顯的3.8kb雜交帶，培養(yǎng)上清均測定出HBV抗原，表明具有生物活性，分別亞克隆入EB病毒表達載體EBO-plpp使能穩(wěn)定表達。重組載體EBO-WT、EBO-L97和EBO-V60作限制性內切酶酶切鑒定及再次測序確定點突變。 測定HBV野生株和變異株L97、V60誘導HepG₂細胞膜HLA-I／抗原肽復合物表達的強度，探討各株在宿主細胞HLA-I表面表達的特性及核殼蛋白熱點變異對HLA-I表達的影響。3株HBV重組載體及EBO空載體分別... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學廣東省

【文章頁數】：39 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

HBv野生株及核殼蛋白變異株質粒轉染細胞HBVDNASouthern雜交結果

圖6HBv轉染細胞內HLA一AmRNA表達M:PCR分子量標準(l543，94，697，515，377，237bP);Lanel:EBO一L97;LaneZ:EBO一WT;Lane3:EBO一V60;Lane4:EBO空載體圖7HBV轉染細胞內HLA一A蛋白質表達的WesternBlot分析Lanel:EBO一V60;LaneZ:EBO一L97;Lane3:EBO一WT;Lane4:EBO空載體:M:蛋白分子量標準表明HBV上調了轉染細胞的HLA一A基因轉錄水平，其上調水平的差異與轉染細胞表面HLA一I表達熒光強度的差別基本一致。W亡Stemblot檢測顯示3株重組載體轉染細胞均呈現明顯的45kDa左右的蛋白帶，符合HLA一1重鏈分子量大小，3株HBV呈現的區(qū)帶強度以L97最強，WT次之，V6O最弱，EBO空載體轉染細胞未出現可見的蛋白帶(圖7)，表明HBV轉染細胞內HLA一1蛋白質表達水平明顯上調，3株HBV表達水平的差別與其細胞表面HLA一1表達熒光強度的差別趨

轉染細胞內HLA一I抗原提呈相關基因的轉錄水平:PZ、TAPI、幾pasin引物用RT一PCR半定量法檢測3株O空載體轉染細胞內相應基因的轉錄水平，結果均未TapasincDNA可見的擴增帶。3株HBV宿主細胞bp的擴增區(qū)帶，各株的區(qū)帶強度無明顯差別，EBO微弱的區(qū)帶(圖8，Lane4一7)。實驗表明HBV轉染H及Tapasin基因轉錄水平無變化，而TAPI基因轉錄株和變異株表達水平相似。


本文編號：2943993