目的 利用小鼠胚胎著床初期1～3天子宮組織塊培養(yǎng)分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，探討獲得胚胎干細(xì)胞的可能性及白蒺藜醇甙(TFAG)對小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響。 方法 分離小鼠胚胎著床初期1～3天(孕4.5～6.5天)小鼠子宮，剪碎后進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，2天內(nèi)分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，以后按常規(guī)的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及傳代方法進(jìn)行傳代。分化誘導(dǎo)實驗是將小鼠胚胎干細(xì)胞在無白血病生長抑制因子(LIF)及無MEF飼養(yǎng)層條件下形成類胚體(EB)，將EB打散成單細(xì)胞，分組添加維甲酸(RA)及TFAG，種植于粘附性的組織培養(yǎng)皿中，誘導(dǎo)分化4天，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察及苔盼藍(lán)活細(xì)胞計數(shù)；再在無RA及TFAG的條件下培養(yǎng)2天后用抗小鼠NF200及GFAP抗體進(jìn)行免疫組化鑒定。 結(jié)果 用這種方法已建立一株小鼠胚胎干細(xì)胞系，傳至第10代，AKP染色強(qiáng)陽性，RT-PCR證實Oct-4表達(dá)強(qiáng)陽性。分化誘導(dǎo)實驗中，各組均加相同濃度RA，其濃度為5×10~(-7)mol/L，不加TFAG的對照組活細(xì)胞計數(shù)為5.5×10~4/ml，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞40％為神經(jīng)元細(xì)胞，10％為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；與對照組比較，實驗組TFAG在濃度分別為5×10~(-3)g/L、5×10~(-4)g/L、5×10~(-5)g/L、5×10~(-6)g/L時，活細(xì)胞計數(shù)分別為對照組的11.9、6.2、2.8、1.2倍，轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元細(xì)胞所占比例分別為對照組的1.9、1.6、1.4、1.1倍，轉(zhuǎn)化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞所占比例無變化。 結(jié)論 1．小鼠胚胎著床初期1～3天子宮組織塊培養(yǎng)可以分離出未分化的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，獲得胚胎干細(xì)胞；與傳統(tǒng)方法相比，這種新方法極大簡化了實驗步驟，降低了實驗技術(shù)難度。2．TFAG可明顯加快轉(zhuǎn)化的神經(jīng)細(xì)胞生長，高濃度時可誘導(dǎo)EB細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

養(yǎng)4天后子宮內(nèi)膜組織團(tuán)塊。4ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化4.1ES細(xì)胞在無LIF條件下培養(yǎng)4天后明顯可見EB形成，懸浮生長，如圖1一12(P，。)所示。4.2EB細(xì)胞團(tuán)經(jīng)RA誘導(dǎo)后，向神經(jīng)細(xì)胞分化的形態(tài)特征:EB細(xì)胞離散成單層，單純經(jīng)RA誘導(dǎo)后第48小時就可見部分神經(jīng)樣細(xì)胞，并有神經(jīng)樣突起;第96小時可見有神經(jīng)突起的延長，并有大量死亡細(xì)胞碎片;再進(jìn)行消化后培養(yǎng)兩天，細(xì)胞在數(shù)量及形態(tài)上有較大改變;經(jīng)免疫組化證實可見較多NFZOO陽性細(xì)胞，如圖1一13(P19)所示。

圖1一9小鼠I以團(tuán)AKP染色。小鼠子宮剪碎后加ES培養(yǎng)基培養(yǎng)，第四天形成明顯的工CM細(xì)胞團(tuán)，AKP染色呈強(qiáng)陽性(100x)圖1一10第10代ES細(xì)胞團(tuán)AKp染色。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)可形成明顯的ES細(xì)胞團(tuán)，AKP染色呈強(qiáng)陽性(400x)圖卜12Es細(xì)胞在無LIF條件下4天后明顯可見EB形成，圖1一13EB細(xì)胞單純經(jīng)RA誘導(dǎo)后用NFZoo免疫組呈懸浮生長，細(xì)胞團(tuán)不規(guī)則橢圓形，邊緣似有分化(200x)化證實可見神經(jīng)元細(xì)胞，NFZoo陽性〔100x)

博士學(xué)位論文第一部分圖1一9小鼠I以團(tuán)AKP染色。小鼠子宮剪碎后加ES培養(yǎng)基培養(yǎng)，第四天形成明顯的工CM細(xì)胞團(tuán)，AKP染色呈強(qiáng)陽性(100x)圖1一10第10代ES細(xì)胞團(tuán)AKp染色。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)可形成明顯的ES細(xì)胞團(tuán)，AKP染色呈強(qiáng)陽性(400x)圖卜12Es細(xì)胞在無LIF條件下4天后明顯可見EB形成，圖1一13EB細(xì)胞單純經(jīng)RA誘導(dǎo)后用NFZoo免疫組呈懸浮生長，細(xì)胞團(tuán)不規(guī)則橢圓形，邊緣似有分化(200x)化證實可見神經(jīng)元細(xì)胞，NFZoo陽性〔100x)圖卜IEB細(xì)胞經(jīng)RA和5、10一3昨的TFAG誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞生長旺盛，免疫組化證實可見大量NF200陽性細(xì)胞(400X)圖2-2EB細(xì)胞經(jīng)RA和sug/L的TFAG誘導(dǎo)后免疫組化證實可見典型神經(jīng)元細(xì)胞
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 沈雙宏;沈曉東;胡隨瑜;杜建;譚春江;;復(fù)方刺蒺藜苷對慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型鼠行為學(xué)的影響[J];福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2008年04期

2 沈雙宏;胡隨瑜;唐鳳英;王勇華;;復(fù)方刺蒺藜苷對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)及海馬CNTF表達(dá)的影響[J];中國臨床心理學(xué)雜志;2006年03期

3 沈雙宏;沈曉東;胡隨遇;杜建;譚春江;;刺蒺藜苷對抑郁模型大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響[J];中醫(yī)藥學(xué)報;2008年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 沈雙宏;復(fù)方刺蒺藜苷對抑郁模型大鼠行為學(xué)、海馬神經(jīng)元CNTF表達(dá)及其神經(jīng)發(fā)生的影響[D];中南大學(xué);2006年

2 黃川原;白松片對慢性抑郁模型大鼠PKA、SYP表達(dá)的影響[D];中南大學(xué);2006年

本文編號：2864410