血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelium growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì) 胞的特異絲裂原，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速新血管形成的作用。VEGF是通 過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的，在胚胎發(fā)育和心 血管、腫瘤等疾病的發(fā)病和防治中具有重要作用。本文著重從以下三個(gè)方面對(duì)VEGF 及其受體Flt-1進(jìn)行了研究。 一、人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF_(165)在Pichia.pastoris中的表達(dá)、純化及其生物學(xué)活 性檢測(cè) 利用PCR技術(shù)，從phVEGF_(165)·SR真核表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)增出hVEGF_(165) cDNA，構(gòu)建酵母 分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/hVEGF_(165)，分別用單交換和雙交換的方法將目的基因整合到 兩種宿主菌GS115和KM71的染色體上。鑒定轉(zhuǎn)化子表型（His~+Mut~s和His~+Mut~+），G418 加壓篩選多拷貝整合菌株，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)在Pichia.pastoris酵母中實(shí)現(xiàn)了hVEGF_(165)的 高效分泌性表達(dá)，SDS-PAGE顯示其表達(dá)量占上清中蛋白總量的60％左右，蛋白質(zhì)定 量分析示其產(chǎn)量約為0.3g/L。ELISA和Western blot表明，表達(dá)產(chǎn)物具有hVEGF_(165) 抗原性。 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Hepsrin-sepharose CL6B親和層析純化后，純度可達(dá)90％以上。 分別采用HUVEC細(xì)胞株MTT比色法及~3H-TdR摻入法對(duì)重組hvEGF_(165)的生物學(xué)活 性進(jìn)行了測(cè)定，兩種方法結(jié)果完全一致，證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物能特異性刺激HUVEC的增殖， 具有天然VEGF的生物學(xué)活性。 二、利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體Flt-1的配體結(jié)合域 利用RT-PCR技術(shù)，從HUVEC中擴(kuò)增出四個(gè)截短的Flt-1 cDNA，分別含胞外第 2，1-2，2-3和1-3個(gè)loop。構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pGBT9/hVEGF_(165)和pGAD424/Flt-1（2）、 pGAD424/Flt-1（1-2）、pGAD424/Flt-1（2-3）、pGAD424/Flt-1（1-3），并將pGBT9/類(lèi) 質(zhì)粒與pGAD424/類(lèi)質(zhì)粒兩兩配對(duì)轉(zhuǎn)化酵母菌SFY526，采用濾紙法和液體培養(yǎng)法對(duì)陽(yáng) 性克隆進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)lt-1（1-3）/hVEGF_(165)轉(zhuǎn)化子2h顯 藍(lán)色，平均活性為65.2IU；Flt-1（2-3）/hVEGF_(165)轉(zhuǎn)化子4h顯色，平均活性為50.8IU； Flt-1（1-2）/hVEGF_(165)轉(zhuǎn)化子10h顯色，平均活性為17.5IU；而Flt-1（2）/hVEGF_(165)轉(zhuǎn) 0 第一軍醫(yī)大學(xué)九七屆博士學(xué)位論文（國(guó)家“‘863”計(jì)劃資助課題） 化子即使 30h以上也沒(méi)有顏色反應(yīng)。說(shuō)明不僅 13lOOp能與 VEGF結(jié)合，比其更小的 ］片段2－3100p也具有與其配體結(jié)合的能力，且結(jié)合能力與 1－310Op斥較接近，1－21。＊ 】的結(jié)合力較弱，單獨(dú)第2個(gè)1剛叩無(wú)配體結(jié)合能力。 I 三、FIt－1胞外1－3和2－3looP在PJCbi。P。storjs中的表達(dá)、純化及其生物學(xué)活 0 性檢測(cè) 0 構(gòu)建酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒 PPICgK／Fit＊（13）和 PPICgK／Fit一1（2一3），利用 OPIChia．pasto廠is 酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)TFlt 一1（1一3）和Fit 一1（2一3）的高效分泌性表 l 達(dá)，SDS－PAGE顯示其表達(dá)量占上清中總蛋白的60％以上，產(chǎn)量約為0．35g／L，ELIS＾ 及Western blot表明，表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性和特異性。 兩種表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) CM一sepharose fast fbwF 離子又換層析和 Sephacryl一100凝 D 膠過(guò)濾層析純化后，純度可這90％以上。 ］固相結(jié)合實(shí)驗(yàn)、固相竟?fàn)幮越Y(jié)合實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)、HUVEC細(xì)胞株 MTT ］t匕色法及屯呵dR摻入法等檢測(cè)方法證實(shí)重組 Fit葉（1刁）和 Fit葉Q刁）都具有結(jié)合 IhVEGF；。。的能力和抑制 hVEGF；。。對(duì) HUVEC 勺促增殖功能，其中前者的作用更為明顯， I 但二者相差不大。 本文成功地利用PIChja．pssto汀s酵母表達(dá)系統(tǒng)，高效表達(dá)了hVEGF；。。，并證實(shí)J 其具有天然 VEGF的生物學(xué)活性，這對(duì)于開(kāi)發(fā)其在缺血性。。臟病及肢體繼發(fā)性動(dòng)脈閉J 塞等疾病的防治開(kāi)辟了廣闊的前景。首次成功地利用酵母雙雜交系統(tǒng)，高效篩選出－ Fit－1胞卜最J、g己體結(jié)合域一2－3looP，并在Pj奶ia．P。sic。is酵母表達(dá)系統(tǒng)中買(mǎi)現(xiàn) 了其高效分泌性表達(dá)，體外生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有與VEGF結(jié)合的能力和抑制D VEGF對(duì)HUVEC的促增殖功能，這為進(jìn)一步研究其在動(dòng)物水平阻斷VEGF的病理作用打 下了良好基礎(chǔ)，為臨床預(yù)防和治療腫瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等血管生成相關(guān)疾病D 提供了新的手段。
【學(xué)位單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2000
【中圖分類(lèi)】：R392.11
【文章目錄】：
縮略詞表
中文摘要
英文摘要
前言
165在Pichia．pastoris中的表達(dá)、純化及其生物學(xué)活性檢測(cè)'>第一部分 人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF₁₆₅在Pichia．pastoris中的表達(dá)、純化及其生物學(xué)活性檢測(cè)
    材料方法
    結(jié) 果
    討 論
    小 結(jié)
第二部分 利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究人血管內(nèi)應(yīng)生長(zhǎng)因子受體Flt-1的配體結(jié)合域
    材料方法
    結(jié) 果
    討 論
    小 結(jié)
第三部分 人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體Flt-1胞外1-3，2-3loop在Pichia．pastoris中的表達(dá)、純化及其生物學(xué)活性檢測(cè)
    材料方法
    結(jié) 果
    討 論
    小 結(jié)
綜述之一 甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母—Pichia．pastoris基因表達(dá)系統(tǒng)
綜述之二 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體的結(jié)構(gòu)和功能
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相關(guān)期刊論文 前1條

1 張曼，周愛(ài)儒;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的功能與應(yīng)用[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1996年03期

本文編號(hào)：2856038