胚胎著床是成功妊娠的第一步，受到激素、細胞因子、蛋白、酶等多種信息物質的調節(jié)，詳細機理尚不清楚。由于著床的機理不清，阻礙了對不孕這種與著床密切相關疾病的深入了解，阻礙了助孕技術水平的提高，同時也阻礙了抗著床干擾生育方法的進一步開發(fā)。著床涉及胚胎和母體子宮雙方的同步發(fā)展和變化，是一個復雜而精細的過程，直接在體研究極其困難，因此，體外模型的建立成為研究此過程的重要工具。目前國內外應用子宮組織、子宮內膜細胞及細胞外基質等已建立了許多著床模型，其中應用最多的是胚泡與單層子宮內膜上皮細胞的共培養(yǎng)。但這些模型絕大多數(shù)只能實現(xiàn)胚泡的粘附和擴展生長，而無胚泡植入子宮內膜的行為。即都不能完全模擬體內著床時胚泡與子宮內膜的關系。研究表明子宮內膜上皮細胞的極性、細胞間連接以及與基質細胞、細胞間基質的關系對于維持子宮內膜的功能非常重要，因此植入過程的研究中，除包含基底膜上有良好細胞間連接的極性上皮細胞外，同時包含細胞間基質和基質細胞也很重要。鑒于這些特點，建立含有子宮內膜上皮和基質細胞的體外培養(yǎng)三維模型，系統(tǒng)觀察子宮內膜細胞的形態(tài)學、細胞骨架的改變，并進一步利用此體外模型觀察雌激素、胚胎以及細胞因子等對子宮內膜容受性的調節(jié)作用，對闡明子宮內膜容受性建立的分子機制，并通過干擾容受性來干擾著床從而實現(xiàn)人類生育調節(jié)具有重要意義。體外模型的建立能夠為研究胚胎著床提供更合理、更科學和更便捷的途經。 第一部分 子宮內膜體外三維模型的建立 一、 子宮內膜上皮細胞和基質細胞共培養(yǎng)三維模型 目的 用雙室培養(yǎng)系統(tǒng)、Matrigel的特性，建立子宮內膜上皮/基質細胞的共培養(yǎng)三維模型，并進一步觀察其形態(tài)學特征并與在體子宮內膜相比較，探索建立理想的體外三維模型。 材料和方法 取孕4天小鼠子宮內膜，用trypsin/pancreatin消化法制備子宮內膜上皮細胞 WP=6 和基質細胞，利用雙室培養(yǎng)系統(tǒng)建立含有上皮細胞和基質細胞的三維模型。用光鏡、電鏡觀察其形態(tài)學特征，并與正常子宮內膜比較；用細胞免疫組化方法鑒定細胞的來源和純度。 結果 用酶消化法分離的上皮細胞和基質細胞，其純度占90％以上。掃描電鏡（SEM）觀察顯示，對照組孕第4天的小鼠子宮蛻膜上皮細胞有突起，表面具有微絨毛及發(fā)育中的胞飲突。體外培養(yǎng)的子宮內膜上皮細胞生長融合成片，同樣可見容受性標志－發(fā)育中胞飲突的形成，上覆微絨毛，只是體外培養(yǎng)的上皮細胞胞飲突變異較大。透射電鏡（TEM）結果顯示，培養(yǎng)的上皮細胞具有極性，表面覆有微絨毛，較在位子宮內膜細胞表面的微絨毛少。同時培養(yǎng)的子宮內膜上皮也具有細胞間緊密連接和糖原沉積，與在體的子宮內膜相似。 小結 建立的三維模型既含有上皮細胞，又包含基質細胞及細胞外基質。其生物學特征與在體的子宮內膜基本相似，是一種較理想的體外模型。 二、 子宮內膜體外重建 目的 用組織工程方法，利用新型的多孔聚合物支架材料膠原—聚乳酸羥基乙酸共聚物雜交聚合網(wǎng)（Collagen-PLGA polymer mesh）作為三維支架，將子宮內膜上皮細胞和基質細胞作為種子細胞，探索建立人工子宮內膜的可行性。 材料和方法 將分離純化的上皮細胞和基質細胞依次種植于生物可降解膠原—聚乳酸羥基乙酸共聚物雜交聚合網(wǎng)上下兩面，光鏡及掃描電鏡觀察細胞的生長狀況。 結果 子宮內膜細胞可進入聚合網(wǎng)內部并粘附生長，24h后細胞粘附。掃描電鏡顯示在細胞培養(yǎng)第5天，細胞大量鋪展生長，有些區(qū)域，可見融合生長。培養(yǎng)第14天后，掃描電鏡見細胞融合成片，原膠原大部分已被子宮內膜細胞分泌的細胞外基質代替，形成三維結構。 WP=7 小結 本實驗首次應用生物可降解的雜交聚合網(wǎng)作為支架在體外重建了子宮內膜，提示用組織工程方法建立人工子宮內膜的可行性。 第二部分 子宮內膜容受性影響因素的研究 一、 胚胎與三維模型共培養(yǎng)及對子宮內膜容受性的調節(jié) 目的 研究表明胚胎因素在誘導子宮容受性中具有重要作用，其具體機制還不清楚。本研究目的是將胚泡與建立的體外三維模型共培養(yǎng)，研究胚胎加入后，子宮內膜細胞的形態(tài)學變化、胚胎與子宮內膜相互作用的關系及對容受性標志分子整合素β3的影響，探索胚胎因素對子宮容受性形成的調節(jié)作用。 材料和方法 給小鼠超排卵刺激后交配，將妊娠第4天的小鼠囊胚培養(yǎng)在已建立的體外子宮內膜三維模型上，電鏡觀察胚胎植入時囊胚與子宮內膜上皮細胞的超微結構。并用RT－PCR法測定子宮內膜整合素β3基因水平的表達，Immunoblot法做整合素β3蛋白半定量測定。 結果 在三維模型中小鼠囊胚能正常脫透明帶、粘附和擴展，小鼠囊胚24h、48h的脫帶率（31.3％、72.5％）、粘附率（16.7％、58.3％）與對照組單層子宮內膜上皮（脫帶率：27.7％、70.8％，粘附率：15.3％、52.8％）相比差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；體外模型中胚胎的48h擴展率16.7％與對照組40.3％相比差異具顯著統(tǒng)計學意義（P0.05）。掃描電鏡顯示體外培養(yǎng)的子宮內膜可形成胞飲突，胚胎粘附于胞飲突上，胚胎表面覆有微絨毛。透射電鏡顯示培養(yǎng)的子宮內膜上皮細胞具
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R321
【部分圖文】：

光鏡觀察消化出的上皮細胞呈團塊狀結構，其中混雜有少量的基質細胞。基質細胞呈單個細胞。見圖1-1-1,1-1-2。子宮內膜上皮細胞及基質細胞分離后用 cytokeratin-18 和 desmin作為細胞表面標志來鑒定子宮內膜細胞的純度。免疫細胞化學結果顯示，上皮細胞呈 Cytokeratin 18 陽性表達，Desmin 陰性�；|細胞呈 Desmin 陽性表達，Cytokeratin 18 陰性。結果顯示用此方法分離的上皮細胞及基質細胞純度達 90％。見圖 1-1-3, 1-1-4。

-2分離的子宮內膜基質細胞的形態(tài)，成單個細胞

-3子宮內膜上皮細胞cytokeratin-18免疫組化染色,
【引證文獻】

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1 吳慶俠;豐艷妮;楚元奎;吳瑞;崔貞亮;靳亞平;;山羊子宮內膜基質細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J];西北農林科技大學學報(自然科學版);2007年04期

相關碩士學位論文 前3條

1 吳慶俠;山羊子宮內膜基質細胞的分離培養(yǎng)[D];西北農林科技大學;2006年

2 盛宏霞;山羊子宮內膜基質細胞分離培養(yǎng)及永生化的研究[D];西北農林科技大學;2008年

3 屈延延;性腺激素對山羊子宮內膜細胞分泌活性及激素受體表達的影響[D];西北農林科技大學;2012年

本文編號：2836396