發(fā)布時間：2020-09-29 20:17

　　 齲病(Dental caries)是發(fā)生在牙齒硬組織(牙釉質(zhì))的細(xì)菌感染性疾病。該病在全球發(fā)病率高、流行范圍廣，是嚴(yán)重危害人類健康的主要口腔疾病之一。長期以來，經(jīng)過各個國家的努力，采取各種方法預(yù)防齲病的發(fā)生，特別是氟化物的應(yīng)用，使齲病的預(yù)防收到了明顯的效果。但是目前的控制措施還未能完全有效地控制齲病的發(fā)生。同時由于氟化物的長期使用，出現(xiàn)了耐氟菌株，這使齲病的預(yù)防形勢更加嚴(yán)峻。這就迫切需要人們開發(fā)新的預(yù)防齲病的措施及治療藥物。 鏈球菌群中的變形鏈球菌(Streptococcus mutans)為主要致齲菌。變形鏈球菌引起齲病的先決條件是其必須在牙齒表面定植，形成生物膜(Biofilm)即牙菌斑(Dental plaque)。定植在牙菌斑內(nèi)的變形鏈球菌可以發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸，使牙釉質(zhì)脫礦。形成生物膜被認(rèn)為是多種口腔致病菌致病因素之一。因此尋找可以抑制變形鏈球菌及其生物膜的方法，是齲病預(yù)防、治療的有效措施。 抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是具有抗菌(包括細(xì)菌、真菌)活性短肽的總稱，具有廣泛的殺菌活性。細(xì)菌細(xì)胞壁是維持細(xì)菌生存所必需的基本結(jié)構(gòu)之一，與真核細(xì)胞不同，其主要的化學(xué)成分是肽聚糖。肽聚糖合成中的一個關(guān)鍵反應(yīng)是UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)與磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)化為UDP-N-乙�；�-3-O-(1-羧基乙烯基)-D-葡糖胺(UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸，UDP-Glc-NAc-EP)。MurA(UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶)是催化此反應(yīng)的酶，因此它是肽聚糖合成過程中的一個關(guān)鍵酶。由于此反應(yīng)途徑無代謝旁路，并且在人體中不存在此種代謝途徑。MurA酶可能是研制預(yù)防齲病藥物的作用靶點(diǎn)之一。 因此，本課題的研究工作包括兩部分。(1)篩選針對致齲性變形鏈球菌及其生物膜有效的抗菌肽，并揭示其作用機(jī)制。(2)針對變形鏈球菌細(xì)胞壁肽聚糖合成關(guān)鍵酶MurA作為藥物靶點(diǎn)，通過克隆表達(dá)得到MurA蛋白，對其進(jìn)行酶促動力學(xué)研究，建立高通量篩選MurA酶抑制劑的分子模型。 第一部分取得的研究結(jié)果： 1.抗菌肽對S. mutans的最低抑菌濃度(MIC) 應(yīng)用96孔板微孔培養(yǎng)基稀釋方法測定三種抗菌肽(P-113、PAC-525、D-Nal-Pac-525)對S. mutans的MIC。MIC分別為P-113＞16μg/ml，PAC-5258μg/ml，D-NAL-PAC-5254μg/ml。確定最佳抗菌肽為D-Nal-Pac-525。 2. D-Nal-Pac-525對S. mutans的生長抑制作用 將不同濃度的D-Nal-Pac-525加入到對數(shù)期初期的S. mutans培養(yǎng)液中，于不同時間點(diǎn)取樣，測OD600，繪制生長曲線。結(jié)果顯示，當(dāng)D-Nal-Pac-525濃度為2μg/ml S. mutans生長趨勢沒有變化，但當(dāng)其濃度升高到4μg/ml S. mutans生長受到明顯抑制。 3. D-Nal-Pac-525對S. mutans的殺菌活性 將D-Nal-Pac-525(終濃度分別為1、2、4μg/ml)加入到S. mutans培養(yǎng)液中(~1×108CFU/ml)，厭氧培養(yǎng)，分別在2、4h取樣，進(jìn)行活菌計數(shù)，當(dāng)D-Nal-Pac-525濃度在4g/ml時，與未加藥的對照相比S. mutans活菌數(shù)量顯著減少。 4.掃描電鏡觀察D-Nal-Pac-525引起S. mutans形態(tài)學(xué)的變化 將D-Nal-Pac-525加入到S. mutans(~108CFU/ml)培養(yǎng)液中，至終濃度為4μg/ml。37oC厭氧培養(yǎng)4h。離心后收集菌體，標(biāo)本經(jīng)過處理固定后用SEM進(jìn)行觀察。與未處理的對照組相比，D-Nal-Pac-525處理后的S. mutans呈現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化。處理組細(xì)菌菌體明顯變長，菌體表面粗糙有皺褶。同時在處理組的照片上觀察到細(xì)菌崩解之后形成的碎片。 5.透射電鏡觀察D-Nal-Pac-525引起S. mutans結(jié)構(gòu)的變化 同樣將D-Nal-Pac-525加入到S. mutans(~108CFU/ml)培養(yǎng)液中，至終濃度為4μg/ml。37oC厭氧培養(yǎng)4h。離心后收集菌體，標(biāo)本經(jīng)過處理固定后用TEM進(jìn)行觀察。D-Nal-Pac-525對S. mutans菌體表面結(jié)構(gòu)的破壞作用。鏡下未處理組菌體表面結(jié)構(gòu)均一，呈高密度線。處理組菌體表面結(jié)構(gòu)變模糊，甚至遭到破壞。同時在處理組菌體內(nèi)部出現(xiàn)了高密度區(qū)域、細(xì)菌染色體凝集現(xiàn)象，胞內(nèi)物質(zhì)凝集及菌體細(xì)胞質(zhì)膜破壞的現(xiàn)象。 6. D-Nal-Pac-525抑制S. mutans生物膜的形成 在PVC96孔板上建立S. mutans生物膜模型。將不同濃度的D-Nal-Pac-525(終濃度為0.25，0.5，1，2，4μg/ml)與S. mutans(~1×105CFU/ml)BHI培養(yǎng)基菌液(含3%蔗糖)共培養(yǎng)。結(jié)果顯示D-Nal-Pac-525在濃度為2g/ml時可以抑制S. mutans生物膜的形成。OD600結(jié)果驗(yàn)證了肉眼觀察的結(jié)果。D-Nal-Pac-525對已經(jīng)形成的生物膜沒有破壞作用。 7.對S. mutans生物膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響 經(jīng)過D-Nal-Pac-525(4μg/ml)處理4h，S. mutans生物膜相關(guān)基因(brpA、vicR及gbpA)的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有發(fā)生變化。 第二部分取得的研究結(jié)果： 1.表達(dá)載體pET16b-Smu murA的構(gòu)建 從S. mutans UA159菌株基因組數(shù)據(jù)庫中查詢出變形鏈球菌(UA159)murA基因(SMU_1525)的核苷酸序列(大小為1272bp)。設(shè)計PCR引物，在上、下游引物的5’端分別加入Nde I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以S. mutans UA159基因組DNA為模板，擴(kuò)增出S. mutans murA基因。 將PCR產(chǎn)物與pMD18T克隆載體連接，再將其轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌Novablue中。用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoR I酶切的方法鑒定重組質(zhì)粒。對pMD18-Smu murA中的murA基因進(jìn)行DNA序列測定。將所測得的核苷酸序列與S. mutans UA159murA (SMU_1525)基因進(jìn)行序列比對，完全一致。說明在本實(shí)驗(yàn)中獲得的murA為正確的S. mutans UA159murA基因。再用Nde I、Xho I雙酶切pMD18-Smu murA質(zhì)粒�；厥�、純化murA基因，連接到pET16b表達(dá)質(zhì)粒的Nde I和Xho I位點(diǎn)，構(gòu)建pET16b-Smu murA表達(dá)載體。用EcoR I酶鑒定陽性重組質(zhì)粒。 2. S. mutans MurA蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)、純化 將pET16b-Smu murA表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中。在37oC振蕩培養(yǎng)3小時，達(dá)到對數(shù)生長期。然后加入終濃度為0.5mM IPTG，室溫誘導(dǎo)細(xì)菌8小時，誘導(dǎo)攜帶pET16b-Smu murA表達(dá)載體的BL21(DE3)菌株表達(dá)重組MurA蛋白。MurA蛋白的N端與質(zhì)粒pET16b上的組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白。用超聲破碎誘導(dǎo)后的BL21(DE3)。分別對上清、沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblotting，結(jié)果表明S. mutans MurA蛋白在BL21(DE3)菌株中可溶性表達(dá)。 用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化MurA蛋白。對蛋白進(jìn)行蛋白定量(考馬斯亮藍(lán)法)，其中第2管MurA蛋白的濃度為1150μg/ml。SDS-PAGE和Westernblotting結(jié)果表明MurA蛋白的純度較高。 3. S. mutans MurA酶活性測定方法的建立 (1)高效液相色譜法(HPLC)：用Nova-Pak C18色譜柱，以三乙胺-醋酸緩沖液為流動相，在260nm處檢測反應(yīng)底物UDP-GlcNAc的減少。 (2)化學(xué)顯色法：S. mutans MurA催化反應(yīng)的產(chǎn)物之一為磷酸，磷酸可以與鉬酸銨形成磷鉬酸復(fù)合物后使孔雀石綠顏色由黃綠變?yōu)樗{(lán)綠。用酶標(biāo)儀在620nm處檢測吸光值變化，以測定所生成磷酸的含量。 4. S. mutans MurA蛋白酶促反應(yīng)動力學(xué)特性的研究 反應(yīng)底物UDP-GlcNAc和PEP與不同濃度MurA在37oC反應(yīng)不同時間。結(jié)果表明S. mutans MurA反應(yīng)初速度酶濃度范圍為1.84μg/ml，時間范圍為5min。 分別改變反應(yīng)的溫度和pH值，利用酶標(biāo)儀在620nm處吸光度值的變化，計算反應(yīng)產(chǎn)物的生成量。確定S. mutans MurA酶蛋白的最適反應(yīng)溫度是37oC，最適pH值是7.5。 采用最佳反應(yīng)條件，保證一種底物過量，改變另一種底物濃度采用雙倒數(shù)法測其Km值和Vmax。37oC，pH7.5，酶濃度為1.84μg/ml，反應(yīng)時間為5分鐘。分別用不同的底物濃度，進(jìn)行酶促反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀檢測620nm處吸光度值，反應(yīng)產(chǎn)物的生成量。用雙倒數(shù)作圖法得出S. mutans MurA的Km值和Vmax。對于底物PEP，Km值為0.086±0.001mM，Vmax為0.098±0.001mM min-1mg-1。對于底物UDP-GlcNAc的Km值為0.120±0.005mM，最大速率Vmax為0.048±0.002mM min-1mg-1。 5.磷霉素對S. mutans MurA功能的驗(yàn)證 用磷霉素(Fosfomycin)進(jìn)一步鑒定純化的S. mutans MurA功能。將一定濃度的磷霉素與MurA蛋白在室溫下預(yù)孵(preincubation)10min后，檢測MurA蛋白活性變化。MurA酶的活性受到磷霉素抑制。在UDP-GlcNAc存在情況下，MurA受到的抑制作用更加明顯。從而證明S. mutans MurA具有UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶活性。 結(jié)論：1.篩選的抗菌肽D-Nal-Pac-525可以抑制變形鏈球菌的生長及生物膜的形成，D-Nal-Pac-525可能成為新的預(yù)防齲病藥物。 2.構(gòu)建了高表達(dá)S. mutans MurA蛋白的工程菌株，可以獲得大量可溶性MurA蛋白。 3.建立了快速、準(zhǔn)確測定MurA酶活性的方法，并建立了高通量篩選MurA酶抑制劑的分子模型，為小分子抑制劑的篩選提供了物質(zhì)保障。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R781.1;R3411
【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
    參考文獻(xiàn)
第一章 抗菌肽 D-Nal-Pac-525 對變形鏈球菌生長及其生物膜形成影響的實(shí)驗(yàn)研究
    材料和方法
        1. 材料
            1.1 菌株
            1.2 抗菌肽的制備
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器
        2. 方法
            2.1 變形鏈球菌生長曲線的測定
            2.2 抗菌肽最低抑菌濃度 ( M I C ） 的測定
            2.3 D-Nal-Pac-525 對 S.mutans 生長抑制試驗(yàn)
            2.4 D-Nal-Pac-525 對 S.mutans 殺菌活性試驗(yàn)
            2.5 掃描電鏡
            2.6 透射電鏡
            2.7 生物膜實(shí)驗(yàn)
            2.8 生物膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的 RT-PCR
            2.9 統(tǒng)計分析方法
    結(jié)果
        1. S.mutans UA159 的微生物學(xué)一般特征
        2. S.mutans 生長曲線的測定
        3. 抗菌肽最低抑菌濃度 ( M I C ） 的測定
        4. D-Nal-Pac-525 對變形鏈球菌生長抑制試驗(yàn)
        5. D-Nal-Pac-525 對 S.mutans 殺菌活性的測定
        6. SEM 觀察 D-Nal-Pac-525 引起的形態(tài)學(xué)變化
        7. TEM 觀察 D-Nal-Pac-525 引起的結(jié)構(gòu)變化
        8. D-Nal-Pac-525 對變形鏈球菌生物膜的作用
        9. D-Nal-Pac-525 對生物膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第二章 變形鏈球菌 MurA(UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶） 的表達(dá)、純化及酶促反應(yīng)動力學(xué)研究
    材料和方法
        1. 材料
            1.1 質(zhì)粒、菌種
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2. 方法
            2.1 S.mutans 基因組的制備
            2.2 S.mutans murA 基因的擴(kuò)增及純化
            2.3 pMD18-Smu murA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.4 pET16b-Smu murA 表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.5 S.mutans MurA 蛋白在在大腸桿菌 BL21 (DE3） 中的可溶性表達(dá)與鑒定
            2.6 S.mutans MurA 酶活性的測定
            2.7 S.mutans MurA 酶的酶促動力學(xué)研究
            2.8 應(yīng)用磷霉素驗(yàn)證 S.mutans MurA 的功能 49
    結(jié)果
        1. S.mutans murA 基因的擴(kuò)增及純化
        2. pMD18-Smu murA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3. S.mutans UA159 murA PCR 產(chǎn)物的 DNA 序列測定
        4. p E T 16 b - S m u m u r A 表達(dá)載體的構(gòu)建
        5. S.mutans MurA 在大腸桿菌 BL21(DE3） 中的表達(dá)、純化與鑒定
        6. S.mutans MurA 酶活性檢測方法的建立
        7. S.mutans MurA 酶促反應(yīng)動力學(xué)的研究
            7.1 M u r A 酶初速度的確定
            7.2 S.mutans MurA 酶最佳溫度及 pH 值的確定
            7.3 底物對 M u r A 酶的 K m 值
        8. 用磷霉素進(jìn)行 S.mutans MurA 酶功能的驗(yàn)證
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況
致謝

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