【摘要】：臨床上,供體器官的嚴(yán)重短缺,使人們將目光轉(zhuǎn)向了異種移植。目前為止,豬被認(rèn)為是最適合的異種移植供體。但研究發(fā)現(xiàn),以前病毒DNA形式整合進(jìn)豬體細(xì)胞基因組中的豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)在體外能夠感染多種人源細(xì)胞,這引起了人們對(duì)異種移植安全性的廣泛關(guān)注。我國(guó)有著豐富的小型豬種資源,目前已經(jīng)開(kāi)展豬-人異種器官/組織移植的相關(guān)研究,但有關(guān)小型豬中PERV的攜帶、表達(dá)情況以及內(nèi)源性釋放毒株的生物學(xué)特性方面報(bào)道甚少,因此有必要開(kāi)展這方面的研究工作,了解我國(guó)小型豬中PERV存在的本底,為異種器官受體提供安全可靠的器官,同時(shí)通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞感染模型與全基因克隆,為進(jìn)一步研究PERV的生物學(xué)特性及PERV對(duì)人源細(xì)胞的感染機(jī)制搭建技術(shù)平臺(tái)。為此本研究主要進(jìn)行以下四個(gè)方面的工作: (1) 中國(guó)特有小型豬PERV存在情況的普查 采集了6個(gè)省市10個(gè)單位、5個(gè)品種、17個(gè)豬群259份血樣,通過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn):我國(guó)小型豬基因組中普遍存在PERV,其陽(yáng)性率達(dá)100%。其中以B亞型最高(95.37%),其次為A亞型(67.18%)、C亞型(42.08%),目前為止沒(méi)有篩選到無(wú)PERV的陰性豬個(gè)體。PERV主要結(jié)構(gòu)蛋白基因gag、pol、env不僅在小型豬基因組中存在,而且都能夠轉(zhuǎn)錄為RNA。除了檢測(cè)不到PERV-C亞型病毒的表達(dá)外,大部分A、B亞型病毒都能夠表達(dá),且A亞型的表達(dá)率高于B亞型。值得注意的是我國(guó)小型豬中各種PERV亞型病毒混合存在的現(xiàn)象十分普遍,有78.38%存在2種以上PERV亞型病毒混合感染,因此小型豬中存在不同PERV亞型病毒重組的可能性。 (2) 不同PERV HEK293細(xì)胞感染模型的建立 利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的G418抗性HEK293細(xì)胞(G418~R293),將五指山豬(WZS)、中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬(ZGSY)、巴馬香豬(BMXZ)、巴馬小型豬(BM)及貴州香豬(GZ)外周血淋巴細(xì)胞分別與G418~R293細(xì)胞共培養(yǎng),通過(guò)G418加壓篩選,除去共培養(yǎng)體系中的豬外周血淋巴細(xì)胞,然后應(yīng)用PCR及RT-PCR的方法對(duì)所制備的感染細(xì)胞模型進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。通過(guò)上述方法已成功建立了5個(gè)來(lái)自小型豬外周血淋巴細(xì)胞的PERV HEK293細(xì)胞感染模型,證實(shí)了豬外周血淋巴細(xì)胞來(lái)源的PERV在體外也能夠感染人源細(xì)胞系,為研究PERV的生物學(xué)特性及病原安全性的評(píng)價(jià)搭建了技術(shù)平臺(tái)。 (3) PERV-WZS株等病毒全基因組序列測(cè)定 本研究利用PCR及RACE技術(shù)完成了五指山小型豬、巴馬小型豬及來(lái)源于HEK293細(xì)胞感染模型的豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的全基因組序列測(cè)定,3個(gè)毒株的大小分別為8639 bp、8595 bp、8689 bp。分型檢測(cè)均為PERV-A亞型病毒。遺傳
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R346
【圖文】：

pol、env基因的引物，對(duì)上述2種小型豬DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別擴(kuò)增到大小約36lbp、15obp及265bp的pERV‘gag、pol、env基因目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(見(jiàn)圖2一1一3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明巴馬小型豬與五指山小型豬PBL一DNA中均存在PEVR特異性核心蛋白基因(ga助、多聚酶基因(pof)、囊膜糖蛋白基因(nev)序列。圖2一1:A:巴馬小型豬PERv‘gga檢測(cè)結(jié)果M.DL一2000Marker;1一20.PBL一DNA:21.293DNAPERV.ggaPCR檢測(cè)結(jié)果B:五指山小型豬PER--vgag檢測(cè)結(jié)果M.DL一2000Marker;l一10.PBL一DNA:11.293DNA

.23PERV亞型表達(dá)的檢測(cè)為了更詳細(xì)的了解中國(guó)小型豬基因組中PERV的表達(dá)情況，我們同樣以巴馬小型豬(封閉群11)、五指山小型豬(近交系)為例，以RT一PCR方法對(duì)上述2種小型豬PBL-RNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，以了解這些存在小型豬基因組中的PERV是否能夠表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴馬小型豬20個(gè)RNA被檢樣品中有85%(17/20)能夠表達(dá)PERVA亞型，50%(10/20)表達(dá)PERVB亞型，同時(shí)表達(dá)A、BZ種亞型豬只占35%(7/20)，僅表達(dá)PERVA亞型占50%(10/20)，僅表達(dá)PERVB亞型占10%(2/20)。在五指山小型豬10個(gè)RNA被檢樣品中，均能同時(shí)表達(dá)A、BZ種亞型，而在巴馬與五指山小型豬所有被檢樣品中均未有PERVC亞型的表達(dá)(表2一5)。分型檢測(cè)結(jié)果表明，我國(guó)小型豬不僅基因組中普遍存在PERVA、B兩種亞型病毒，而且大部分都能表達(dá)，但到目前為止，都未檢測(cè)到C亞型病毒的表達(dá)。

pol、env基因的引物，對(duì)上述2種小型豬DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別擴(kuò)增到大小約36lbp、15obp及265bp的pERV‘gag、pol、env基因目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(見(jiàn)圖2一1一3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明巴馬小型豬與五指山小型豬PBL一DNA中均存在PEVR特異性核心蛋白基因(ga助、多聚酶基因(pof)、囊膜糖蛋白基因(nev)序列。圖2一1:A:巴馬小型豬PERv‘gga檢測(cè)結(jié)果M.DL一2000Marker;1一20.PBL一DNA:21.293DNAPERV.ggaPCR檢測(cè)結(jié)果B:五指山小型豬PER--vgag檢測(cè)結(jié)果M.DL一2000Marker;l一10.PBL一DNA:11.293DNA

【引證文獻(xiàn)】

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1 丁芳;呂茂民;馬玉媛;吳健敏;田克恭;畢丁仁;章金剛;;豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒5′非編碼區(qū)啟動(dòng)子活性的分析[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年02期

2 歐陽(yáng)康;鄧世杰;吳健敏;陳鳳蓮;張啟模;郭亞芬;;不同代次廣西巴馬小型豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒3′UTR克隆及結(jié)構(gòu)和調(diào)控元件分析[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年08期

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1 歐陽(yáng)康;鄧世杰;吳健敏;陳鳳蓮;張啟模;郭亞芬;;不同代次廣西巴馬小型豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒3′UTR克隆及結(jié)構(gòu)和調(diào)控元件分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)——第二屆中國(guó)獸醫(yī)臨床大會(huì)論文集(下冊(cè))[C];2010年

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1 丁芳;豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)、啟動(dòng)子活性分析及載體構(gòu)建[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

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2 潘漢世;廣西巴馬小型豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)及分子生物學(xué)特性的研究[D];廣西大學(xué);2007年

3 靳二輝;近交系五指山小型豬解剖組織學(xué)研究及內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）的檢測(cè)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2792268