【摘要】：乙型肝炎病毒感染是全球性公共衛(wèi)生問題,現(xiàn)有3.5 億患者受其困擾,能和乙肝病毒表面特異性位點結合并封閉其侵襲肝細胞活性的單克隆抗體和抗體片段是唯一能用于緊急預防的生物制品。本文在前期工作的基礎上,將篩選到的抗HBsAg Fab 片段改造成單鏈抗體(single-chain Fv against HBsAg, HBscFv),分別在大腸桿菌和巴氏畢赤酵母中表達,并對表達產(chǎn)物進行純化及體內(nèi)外生物學活性和理化性質(zhì)鑒定。 采用基因重疊延伸拼接法構建抗HBsAg 單鏈抗體基因,測序確認后,亞克隆至原核表達載體pQE-40,獲得表達質(zhì)粒pQE-HBscFv,并轉入宿主菌E.coli M15[pREP4],獲得工程菌M15[pQE-HBscFv];工程菌經(jīng)IPTG 誘導后,合成大量重組HBscFv,其含量可達菌體總蛋白的31.2%;進一步實驗表明,重組HBscFv主要以包涵體的形式存在于細胞質(zhì)中;將表達質(zhì)粒pQE-HBscFv 轉化有利于二硫鍵形成的氧化還原系統(tǒng)缺陷型宿主菌E. coli Origami(DE3),產(chǎn)物仍為包涵體;對包涵體進行簡單復性后測定復性產(chǎn)物活性,結果表明,重組HBscFv 具有特異性結合HBsAg 活性。 對大腸桿菌表達的HBscFv 包涵體進行純化和復性。優(yōu)化條件誘導HBscFv表達,獲得的包涵體采用4 種方案分別進行純化,發(fā)現(xiàn)以IMAC 一步法純化可得純度超過85%的HBscFv,IMAC/GF 組合方案可得純度超過97%的蛋白;對純化的包涵體采用多種方法復性,發(fā)現(xiàn)透析法比稀釋法或?qū)游鲋粡托苑ㄐ矢?在透析復性法中,鹽酸胍透析復性法比尿素透析復性法效率要高;在最優(yōu)的復性條件下,蛋白回收率為(61.08±1.45)%,相對比活性為(2.66±0.13) A450/630 U/μg;在搖瓶培養(yǎng)階段,重組HBscFv 的純化產(chǎn)量為34.7 mg/L。 對重組HBscFv 的生物學活性和理化性質(zhì)進行鑒定。非競爭酶免疫法親和常數(shù)測定結果表明,HBscFv 是中等親和力抗體,親和常數(shù)為(2.30±0.32)×107 M-1;利用轉基因小鼠測定重組HBscFv 在體內(nèi)的中和活性,發(fā)現(xiàn)重組HBscFv 具有體內(nèi)中和活性,中和效價為31.58 U/mg。應用MALDI-TOF MS 測定HBscFv 分子量,發(fā)現(xiàn)HBscFv 分子量為27314Da,與理論值相差只有8Da;對HBscFv 進行肽質(zhì)量酶譜分析,結果在質(zhì)譜圖上找到超過60%的酶解片段,并且包含N 末端的5 個連
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：R392
【圖文】：

人源化抗體結構示意圖

單鏈抗體衍生物的種類較多，可以是多價抗體，也可以是多特異性抗體[148]，它們的結構示于圖1-2 中。相對于全抗體來說，小分子抗體在臨床應用上更有優(yōu)勢，它們對實體瘤的穿透力強、血清廓清速度高，并可通過各種展示文庫表達。通過與金屬蛋白、毒素或藥物等活性物質(zhì)融合，小分子抗體可以獲得新的活性。這在活體影像診斷方面有廣闊前景，放射性標記的單鏈抗體已成功用于腫瘤的顯影[105]；此外，小分子抗體還可以構建成雙特異性抗體或雙價抗體及多價抗體。

圖 2-1 基因 SOEing 構建 HBscFv 原理Fig. 2-1 Principle of construction of HBscFv by gene SOEin1 2 3Lane 1, PCR molecular markerLane 2, Negative controlLane 3, HBscFv PCR product (763bp)

【引證文獻】

相關博士學位論文 前2條

1 王秀敏;煙草蝕紋病毒CP、HC-Pro基因克隆及與甘蔗花葉病毒之間交互保護作用的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2006年

2 張建新;西瓜花葉病毒基因組全序列分析及其蚜蟲體內(nèi)受體蛋白的分離與鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學;2007年

本文編號：2791711