【摘要】：甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)屬于血清C型凝集素,是機(jī)體天然免疫的重要分子之一,這種高度保守的糖蛋白主要由肝細(xì)胞合成并以三聚體亞單位組成的多種寡聚體形式在血清中循環(huán),其寡聚體形式可廣泛識(shí)別多種病原體表面的糖結(jié)構(gòu),并通過(guò)激活2個(gè)MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MBL associated serine proteases, MASP-1, MASP-2)以不依賴于抗體和Clq的方式激活補(bǔ)體系統(tǒng),發(fā)揮細(xì)胞溶破和間接調(diào)理功能。目前已知的MBL受體包括吞噬細(xì)胞表面膠凝素受體,能通過(guò)二者的結(jié)合而起直接調(diào)理作用,并在調(diào)節(jié)炎癥和啟動(dòng)細(xì)胞調(diào)亡過(guò)程中發(fā)揮作用。MBL、Clq和SP-A、SP-D屬于可溶性模式識(shí)別受體(Patteren Recognition Receptor, PRR),是防御性膠原家族成員。而PRR的配體稱為病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-Associated Molecule Pattern,PAMP),是一組或幾大組病原體所共有、對(duì)其生存絕對(duì)必要且宿主機(jī)體沒(méi)有的保守成分。MBL能夠以其球狀羧基端識(shí)別病原體表面特異性PAMP,引發(fā)機(jī)體迅速有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答。此外,MBL對(duì)病原體具有廣譜識(shí)別作用,可結(jié)合免疫球蛋白；參與對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬以及MBL依賴的Th細(xì)胞活化和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。近年發(fā)現(xiàn),大鼠MBL可以刺激肝臟Kupffer細(xì)胞對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球的吞噬；重組人MBL可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞株THP-1對(duì)大腸桿菌的吞噬。另一方面,細(xì)胞因子和抗原提呈細(xì)胞在決定感受到危險(xiǎn)信號(hào)后所發(fā)生的免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)度時(shí)具有重要作用。MBL可與單核細(xì)胞(Monocyte, Mo)和樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DC)結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌,抑制LPS/CD14誘導(dǎo)的單核細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子TNF-α,同時(shí)上調(diào)抑制性細(xì)胞因子的分泌；抑制DC-SIGN介導(dǎo)的對(duì)T細(xì)胞的感染。研究表明,膠凝素家族成員肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白SP-A、SP-D亦可與多種免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞結(jié)合,在天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能,如增強(qiáng)吞噬細(xì)胞表面受體的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和自由基的釋放,清除自身凋亡細(xì)胞。 樹(shù)突狀細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,且能夠通過(guò)分泌特異性的細(xì)胞因子和與T、B細(xì)胞的相互作用有效啟動(dòng)免疫系統(tǒng)和介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)。研究者最初對(duì)于DC的認(rèn)識(shí)并無(wú)抗原攝取功能,但隨后發(fā)現(xiàn)DC在吞噬活性、遷移能力和介導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答系統(tǒng)方面皆具有其精確的階段性調(diào)控機(jī)制,能夠有效地刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化,從而啟動(dòng)和調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答,故在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特的地位。但是由于DC在人體內(nèi)的數(shù)量有限且功能復(fù)雜多樣,對(duì)于其體外分化發(fā)育、抗原提呈、功能調(diào)控等諸多方面的研究存在著許多空白。最初的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),人源未成熟DC可以誘導(dǎo)異體抗原反應(yīng)性Treg的生成,而新近研究表明,在機(jī)體處于感染狀態(tài)時(shí),由病原體釋放的Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)激動(dòng)劑能夠在Mo分化早期抑制其分化為常規(guī)未成熟DC,而發(fā)展為CD14+CD1a-的調(diào)節(jié)性細(xì)胞亞群。此外,應(yīng)用Yssel's培養(yǎng)基能夠?qū)o來(lái)源DC誘導(dǎo)為以CDla-產(chǎn)生IL-10而無(wú)IL-12分泌為特征的免疫抑制型DC亞群,同時(shí)發(fā)現(xiàn),新分離單核細(xì)胞的初始24h是改變DC后期表型的重要階段,此后再加入刺激因素,DC將傾向于向常規(guī)方向分化。 其中,CD1家族分子在體內(nèi)抗微生物感染過(guò)程中主要負(fù)責(zé)脂類抗原提呈,在Mo細(xì)胞來(lái)源DC的分化早期高表達(dá),是DC分化發(fā)育中的標(biāo)志性表面分子。CDla的表達(dá)往往適應(yīng)于DC的功能需要,細(xì)胞捕獲抗原時(shí)常見(jiàn)CDla高表達(dá),當(dāng)細(xì)胞處于抗原提呈狀態(tài)時(shí),其表達(dá)水平相應(yīng)下調(diào)。病理?xiàng)l件下,CDla往往表達(dá)在CD83+的DC亞群中,已有研究證實(shí),CD1蛋白是誘導(dǎo)有效細(xì)胞免疫的必要條件,其表達(dá)與麻風(fēng)病分型直接相關(guān)。CD1+CD83+單核細(xì)胞來(lái)源的DC對(duì)于鑒別Mo的分化方向、活化CD1限制性T細(xì)胞起重要作用,且在臨床治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)中具有指導(dǎo)性意義。 本課題通過(guò)體外分離培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化為DC,在各實(shí)驗(yàn)組中加入MBL及其它刺激因素,分別在DC的早期分化階段、未成熟階段和成熟階段連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài),檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)志、細(xì)胞功能及其相關(guān)機(jī)制,闡明MBL在此過(guò)程中的作用。初步揭示了MBL可通過(guò)調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的分化方向,促進(jìn)CD14+CD1alow調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的生成,并影響樹(shù)突狀細(xì)胞各發(fā)育階段的表型和功能,從而有效聯(lián)系機(jī)體天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng),最終發(fā)揮抵抗病原體感染和調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫應(yīng)答強(qiáng)度的雙重作用。 第一章MBL對(duì)人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)為調(diào)節(jié)性DC的研究 CDla分子是一類具有與MHCI和MHCII高度同源性的兼具抗原肽的識(shí)別與提呈功能的非典型抗原提呈分子。多數(shù)研究表明,只有郎格罕斯細(xì)胞(LC)和某些皮膚DC及胸腺細(xì)胞能夠表達(dá)CDla,此外,CDla的表達(dá)水平與DC的成熟狀態(tài)密切相關(guān),未成熟DC高表達(dá)CDla,具且有較強(qiáng)的抗原捕獲能力,而隨著DC在抗原刺激下的逐步成熟,其抗原提呈能力提高而捕獲抗原能力下降,此時(shí)CDla的表達(dá)也隨之減少。 本實(shí)驗(yàn)中,取健康人外周血采用密度梯度離心法和磁珠分選獲得高純度單核細(xì)胞,聯(lián)合應(yīng)用IL-4和GM-CSF成功誘導(dǎo)出大量DC細(xì)胞。在單核細(xì)胞向DC誘導(dǎo)分化的早期階段(d0),分別加入MBL和無(wú)關(guān)蛋白HSA,經(jīng)常規(guī)培養(yǎng),分別在第2天和第5天收獲細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面Mo標(biāo)志性分子CD14、CDllb的表達(dá)水平,同時(shí)檢測(cè)DC標(biāo)志性共刺激分子CD80、CD40、CD86、 CDla、CD83以及MHCⅡ類分子HLA-DR的表達(dá),并通過(guò)PCR和ELISA分別在基因和蛋白水平檢測(cè)MBL對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)譜的影響。 結(jié)果表明,MBL刺激組獲得DC細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(F=7.169,P=0.026,多重比較結(jié)果P0.01),且無(wú)凋亡現(xiàn)象發(fā)生,提示MBL可能以非調(diào)亡方式抑制單核細(xì)胞向常規(guī)DC方向的分化,同時(shí)我們觀察到,該DC前體細(xì)胞持續(xù)表達(dá)單核細(xì)胞標(biāo)志CD14,上調(diào)CD11b表達(dá),而常規(guī)DC標(biāo)志分子CDla低表達(dá),CD80、 CD40和HLA-DR水平均下調(diào)(FCD80=0.216, PCD80=0.667, FCD40=0.242, PCD40=0.649,多重比較P CD800.05, P CD400.05; FHLA-DR/d2=3.582, P HLA-DR/d2=0-095,多重比較P HLA-DR/d20.05; FHLA-DR/d5=3.113, PHLA-DR/d5=0.118,多重比較PHLA-DR/d50.05),在此檢測(cè)期內(nèi)CD83僅少量表達(dá)。該細(xì)胞亞群以分泌IL-10、IL-6為特征(FIL-10=4.890, PIL-10=0.055, FIL-6=4.111, PIL-6=0.075,多重比較P IL-100.01, P IL-60.01),幾乎無(wú)IL-12分泌(FIL-12=2.133, PIL-12=0.200,多重比較P IL-120.01),,幾乎無(wú)IL-12分泌,因此推測(cè)在DC分化早期加入MBL,可能誘導(dǎo)出與常規(guī)DC表型和功能不同的DC細(xì)胞亞群。 此部分工作首先為后續(xù)的機(jī)制研究提供了充足穩(wěn)定的MBL蛋白,經(jīng)鑒定,MBL純度較高且能夠保持其天然生物活性,采用磁珠分選獲得了高度純化的單核細(xì)胞并具備良好的細(xì)胞活力用于DC細(xì)胞體外誘導(dǎo),該誘導(dǎo)方法穩(wěn)定、可重復(fù)性高,保證了實(shí)驗(yàn)所需的DC細(xì)胞來(lái)源。同時(shí),初步確定了MBL可能誘導(dǎo)早期單核細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性DC亞群,針對(duì)這一現(xiàn)象,完成了對(duì)DC細(xì)胞表型和細(xì)胞因子表達(dá)特征的檢測(cè)。 第二章MBL對(duì)單核細(xì)胞誘導(dǎo)為調(diào)節(jié)性DC亞群的機(jī)制及功能的初步研究 最近研究表明,漿細(xì)胞來(lái)源DC分泌低水平IL-12并促進(jìn)T細(xì)胞向Th2亞群分化,而單核細(xì)胞來(lái)源DC則通過(guò)產(chǎn)生高水平IL-12誘導(dǎo)T細(xì)胞向Thl型分化。由于該研究中的DC細(xì)胞來(lái)源于不同的細(xì)胞前體,而同一細(xì)胞群體是否能分化出功能各異并且分泌不同細(xì)胞因子的DC亞群尚不得而知。Yssel等發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞向DC分化的常規(guī)培養(yǎng)基中加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞麻油酸、油酸及棕櫚酸能夠促使單核細(xì)胞分化為CD14+DC,該細(xì)胞亞群即使在LPS和IFN-γ的刺激下仍然表現(xiàn)為CDla-并且不分泌IL-12,研究人員將該類DC細(xì)胞定義為mDC2,并且證實(shí),其顯著特征為CDla—和缺乏IL-12表達(dá),并且能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化方向,促進(jìn)產(chǎn)生Th0/Th2細(xì)胞。髓系DC的分化往往依賴于GM-CSF的激活,GM-CSF通過(guò)特異性非受體酪氨酸激酶JAKs和信號(hào)傳導(dǎo)和激活轉(zhuǎn)錄因子STAT,尤其是JAK2和STAT5介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮作用。 由此,本實(shí)驗(yàn)將該細(xì)胞亞群與T細(xì)胞混合培養(yǎng),結(jié)果表明在分化早期受到MBL刺激的未成熟DC具有抑制T細(xì)胞增殖活化,抑制其IFN-y分泌的功能,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F1：5=2.280,P1：5=0.183,多重比較P1：50.01；F1:5(anti-CD3/CD28):=8.544, P1:5(anti-CD3/CD28)=0.018,多重比較P1:5(anti-CD3/CD28)0.05, F1:20(anti-CD3/CD28)=3.527, P1:20(anti-CD3/CD28)=0.097,多重比較Pi:20(anti-CD3/CD28)0-05)。CDla低表達(dá)和IL-12缺乏影響這類細(xì)胞的抗原提呈功能,但是并不影響其對(duì)抗原的攝取能力。同時(shí),通過(guò)Westernblot信號(hào)通路分析,發(fā)現(xiàn)MBL可顯著抑制STAT5、JNK表達(dá)以及胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERKl磷酸化水平,而刺激PU.1、STAT3活性增強(qiáng),由此證實(shí)了粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子依賴性STAT5/JAK2通路可能為MBL的作用靶點(diǎn),從而調(diào)控細(xì)胞表型及其細(xì)胞因子表達(dá)譜。此外,實(shí)驗(yàn)證實(shí)該DC細(xì)胞亞群在LPS刺激下仍能夠分化為CD83+DC。 第三章MBL對(duì)人單核細(xì)胞來(lái)源DC成熟的影響及機(jī)制的初步研究 在本實(shí)驗(yàn)室已有DC研究基礎(chǔ)上,本部分實(shí)驗(yàn)深入探索MBL對(duì)人單核細(xì)胞來(lái)源DC成熟的影響及其機(jī)制。首先常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)DC,在第5天獲得表型和功能穩(wěn)定的未成熟DC細(xì)胞(imDC),繼續(xù)培養(yǎng)2天,其中實(shí)驗(yàn)組加入MBL,在相同培養(yǎng)條件下加入HSA作為無(wú)關(guān)蛋白組,在第7天收集成熟DC及培養(yǎng)上清,采用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA,在細(xì)胞分子水平分別檢測(cè)MBL對(duì)人單核細(xì)胞來(lái)源的DC成熟的影響,并通過(guò)Western Blot在蛋白水平對(duì)刺激因素靶向調(diào)控的信號(hào)通路機(jī)制予以證實(shí)。結(jié)果提示,在天然免疫識(shí)別分子MBL存在的條件下,DC表面分子CD83、CD86、CD80、CD40和MHCⅡ類分子HLA-DR的表達(dá)均上調(diào),且能促進(jìn)同種異體非抗原特異性T細(xì)胞增殖。與DC前體細(xì)胞向未成熟DC分化的作用相反,MBL在未成熟DC向成熟DC發(fā)育的過(guò)程中刺激STAT5表達(dá),抑制STAT3和SOCS活化,上清中IL-12、表達(dá)顯著增加(FIL-12=1.468,PIL-12=0.295,多重比較P＜0.05), TNF-α分泌無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(FTNF-α=1-049, PTNF-α=0.422,多重比較P=0.973)。提示MBL促進(jìn)未成熟DC向成熟DC的轉(zhuǎn)化,通過(guò)影響抗原提呈細(xì)胞在其各個(gè)發(fā)展階段的功能,調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答強(qiáng)度,最終指導(dǎo)人體的獲得性免疫系統(tǒng)的應(yīng)答。 綜上所述,MBL作為識(shí)別和清除入侵病原體的重要防御性分子,在發(fā)揮宿主天然免疫應(yīng)答的作用之外,我們的工作證實(shí)了MBL能夠通過(guò)調(diào)節(jié)APC的分化發(fā)育和功能而參與獲得性免疫應(yīng)答,尤其能夠在Mo向DC分化早期影響其分化方向,在此特定的發(fā)育階段內(nèi)促進(jìn)調(diào)節(jié)性DC亞群的形成。這類CD14+CD1alowDC細(xì)胞以分泌IL-10、IL-6,低水平分泌IL-12為其特征,低表達(dá)多種表面共刺激分子,負(fù)向調(diào)節(jié)初始T細(xì)胞應(yīng)答。此外,我們通過(guò)對(duì)其分子機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路的分析,初步揭示了MBL調(diào)節(jié)DC發(fā)育的雙重作用,可能是MBL作為天然免疫防御蛋白在感染等病理?xiàng)l件下參與調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答強(qiáng)度以及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2781109