【摘要】：脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)是存在于正常人和動(dòng)物血清中的一種糖蛋白,屬于I型急性期反應(yīng)蛋白,與脂多糖(LPS)的類(lèi)脂A部分具有高度親和性。LBP具有致炎和抗炎的雙重作用。LBP既可將LPS多聚體轉(zhuǎn)換為單聚體,加速LPS與其受體CD14結(jié)合,顯著放大LPS的致炎作用;也可加速LPS與靶細(xì)胞膜上的清除受體結(jié)合,使LPS被靶細(xì)胞清除;還可催化LPS與脂蛋白結(jié)合,后者可中和LPS的生物學(xué)活性,加速體內(nèi)LPS的清除。LBP的不同作用可能是由不同功能位點(diǎn)決定的。當(dāng)LBP的某一功能位點(diǎn)與LPS的類(lèi)脂A結(jié)合時(shí),表現(xiàn)為對(duì)LPS的增敏作用;而當(dāng)另一功能位點(diǎn)與LPS的類(lèi)脂A結(jié)合時(shí),則可增強(qiáng)LPS的內(nèi)化,表現(xiàn)為對(duì)LPS的抑制性調(diào)理作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)研究LBP的致炎功能位點(diǎn)和抗炎功能位點(diǎn),并獲得具有抑制LBP致炎活性的可溶性多肽。 方法: 1. 采用經(jīng)典的親和富集法對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行4輪親和篩選, 以LPS為靶分子,前2輪采用酸洗脫,第3、4輪采用LBP競(jìng)爭(zhēng)性洗脫,獲得可與LBP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LPS的噬菌體克隆。應(yīng)用結(jié)合實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證。 2. 應(yīng)用細(xì)胞因子生成抑制實(shí)驗(yàn),即通過(guò)ELISA法測(cè)定人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNFα含量,對(duì)篩選出的噬菌體克隆進(jìn)行功能性篩選,獲得具有阻斷LBP致炎作用的噬菌體克隆。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察LPS的內(nèi)化,獲得具有阻斷LBP抗炎作用的噬菌體克隆。 3. 將獲得的噬菌體克隆進(jìn)行DNA測(cè)序,根據(jù)噬菌體克隆基因中所插入的外源DNA序列推導(dǎo)出呈現(xiàn)的外源多肽氨基酸序列。應(yīng)用Blast軟件將多肽序列與LBP分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列比較分析,對(duì)LBP的致炎和抗炎功能位點(diǎn)進(jìn)行定位。 4. 根據(jù)獲得的具有阻斷LBP致炎作用的噬菌體克隆呈現(xiàn)的外源多肽序列,采用FMOC固相合成法化學(xué)合成具有阻斷LBP致炎活性的游離型多肽。 5. 用細(xì)胞因子生成抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)合成多肽的抗炎活性。 結(jié)果: 1. 采用親和篩選方法,以LPS為靶分子,經(jīng)過(guò)2輪篩選,從噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù) WP=11 中獲得了可與LPS結(jié)合的噬菌體克隆。再經(jīng)過(guò)2輪LBP競(jìng)爭(zhēng)性篩選,獲得了可與LBP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LPS的噬菌體克隆。 2. 從獲得的可與LBP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LPS的噬菌體肽庫(kù)中隨機(jī)挑取100個(gè)噬菌體克隆,進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)100個(gè)克隆中有72個(gè)克隆與LPS有較高的結(jié)合活性,進(jìn)一步的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)表明其中16個(gè)噬菌體克隆具有與LBP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LPS的活性,進(jìn)一步進(jìn)行功能篩選。 3. 細(xì)胞因子生成抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),9個(gè)噬菌體克隆可顯著抑制LBP增敏LPS誘導(dǎo)PBMC分泌TNFα 的作用; LPS內(nèi)化抑制實(shí)驗(yàn)表明,這9個(gè)噬菌體克隆均無(wú)抑制LBP增強(qiáng)LPS內(nèi)化作用的活性,其展示肽具有抑制LBP致炎作用的活性。根據(jù)上述9個(gè)噬菌體克隆基因中插入的外源DNA序列推導(dǎo)出呈現(xiàn)的多肽序列,這9個(gè)噬菌體克隆融合多肽的核心序列為WKXRKXFXKXXG,LBP分子一級(jí)結(jié)構(gòu)中有一個(gè)與多肽序列相似的序列,位于LBP分子的91-102位氨基酸WKVRKSFFKLQG,LBP的91-102位氨基酸片段可能為其致炎功能位點(diǎn)。 4. LPS內(nèi)化抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),3個(gè)噬菌體克隆具有抑制LBP增強(qiáng)LPS內(nèi)化作用的活性;細(xì)胞因子生成抑制實(shí)驗(yàn)表明,這3個(gè)噬菌體克隆均無(wú)抑制LBP增敏LPS誘導(dǎo)PBMC分泌TNFα 的作用,這3個(gè)噬菌體克隆所展示的融合多肽具有抑制LBP抗炎作用的活性。這3個(gè)噬菌體克隆融合肽DNA序列一致,推導(dǎo)融合表達(dá)的12肽序列為FHTRWNYWPYLH,可以模擬LBP的抗炎功能位點(diǎn)。LBP分子一級(jí)結(jié)構(gòu)中沒(méi)有與FHTRWNYWPYLH相似的序列,提示該序列可能是LBP與LPS結(jié)合的一個(gè)模擬位點(diǎn),而不是線性位點(diǎn)。 5. 應(yīng)用FMOC固相合成法成功合成LBP致炎活性抑制肽,多肽序列為L(zhǎng)BP91-102氨基酸序列WKVRKSFFKLQG-NH2,純度在95%以上,分子量1523.6,與理論值相符。合成的LBP致炎作用抑制肽可顯著抑制LBP增敏LPS誘導(dǎo)PBMC分泌TNFα 的活性。 結(jié)論: 1. 本研究成功的從噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)中篩選獲得了可與LBP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LPS的噬菌體克隆。 2. 篩選獲得的具有特異抑制LBP致炎作用的噬菌體克隆展示肽的核心序列為WKXRKXFXKXXG,與LBP分子的91-102位氨基酸WKVRKSFFKLQG有明顯同源性,LBP的91-102位氨基酸序列WKVRKSFFKLQG可能為其致炎功能位點(diǎn)。 3. 篩選得到的具有特異抑制LBP抗炎作用的噬菌體克隆展示肽的序列為 WP=12 FHTRWNYWPYLH,可以模擬LBP的抗炎功能位點(diǎn)。該序列與LBP分子一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性低,提示FHTRWNYWPYLH可能是LBP與LPS結(jié)合的一個(gè)模擬表位,可以模擬LBP的抗炎功能位點(diǎn)。 4. 應(yīng)用FMOC固相法成功合成12肽WKVRKSFFKLQG-NH2,此多肽具有顯著抑制LBP增敏LPS誘導(dǎo)PBMC分泌TNFα 的活性。 上述研究研究結(jié)果對(duì)于闡明LBP在LPS所致內(nèi)毒素血癥中的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)毒素血癥中致炎和抗炎的平衡關(guān)系奠定基礎(chǔ),并為內(nèi)毒素血癥的防治探索新途徑。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R346
【圖文】：

(4). TNFαELISA 檢測(cè)方法同上。（三）、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ( x±s)表示，采用 SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和t 檢驗(yàn)，P㩳0.05 為相差顯著。結(jié) 果1. LBP 抑制肽合成采用 FMOC 固相合成法成功合成具有 LBP 的 91-102 位氨基酸序列的多肽WKVRKSFFKLQG-NH2，并在其 C 端加 NH2修飾以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。合成后的粗肽經(jīng)過(guò)脫鹽后進(jìn)行反向 HPLC 純化，純度超過(guò) 95%。得到的多肽純品進(jìn)行質(zhì)譜分析測(cè)定分子量為 1523.6，與理論值相符，說(shuō)明合成的多肽結(jié)構(gòu)正確，純度合乎測(cè)試要求，可用于生物學(xué)活性的檢測(cè)與評(píng)價(jià)。合成肽的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖 35，色譜圖見(jiàn)圖 36。

圖 36 LBP 抑制肽 HPLC 色譜圖Fig36 The HPLC cromatogram of LBP inhibitor peptide2. LBP 抑制肽的生物學(xué)活性鑒定（1）不同濃度 LBP 抑制肽對(duì) LBP 增強(qiáng) LPS 誘導(dǎo) PBMC 分泌 TNFα的抑制研究發(fā)現(xiàn) PBMC+rhLBP 組、PBMC+20μM peptide 組、PBMC+rhLBP+2ide 組與 PBMC 組之間 TNFα含量差別不顯著（P㧐0.05），表明 rhLBP 和 L均無(wú)直接增強(qiáng)或抑制 LPS 致炎作用；PBMC+LPS 組 TNFα含量顯著高于 PP㩳0.01），PBMC+LPS+LBP 組 TNFα含量顯著高于 PBMC+LPS 組（P㩳0.01BP 具有增敏 LPS 致炎作用； 0.02μM 抑制肽使 LBP 增敏 LPS 誘導(dǎo) PBMCα有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P㧐0.05）； 而 0.2μM 抑制肽即有顯著抑P㩳0.05），這個(gè)濃度為 LBP 抑制肽顯著抑制 10ng/ml LBP 增強(qiáng) 10ng/ml LPS

PBMC空白對(duì)照的流式細(xì)胞分析

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本文編號(hào)：2781097