發(fā)布時間：2020-07-28 19:58

【摘要】： 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌及胃MALT瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系，發(fā)展中國家60-80％的人群有Hp感染。VacA(vacuolating cytotoxin)是Hp分泌的一種毒素，于體外可導致哺乳動物真核細胞產(chǎn)生空泡變性，在Hp的致病過程中起重要作用，但其空泡毒性作用的確切機理尚不清楚。開展VacA的研究工作需要大量的VacA抗原，Hp的濃縮上清雖具有明顯的空泡活性，但因其蛋白成分復雜而不能完全取代高純度的VacA用于研究。因此，本研究的目的是通過對多種Hp液體培養(yǎng)方法及液相層析方法的篩選，建立一種簡便、可行、可靠的VacA純化流程，從而使該抗原的大量制備成為可能，為進一步研究VacA毒素的致病機理，包括VacA受體的研究提供物質基礎。同時評價中性紅攝入法(NRU)檢測細胞空泡毒性的應用價值，為研究VacA的作用機制提供可靠的技術方法。在上述基礎上，采用蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)及蛋白酪氨酸激酶(PTK)的抑制劑，觀察其對VacA空泡毒性的影響，探討VacA對胃粘膜上皮細胞信號轉導通路的作用及VacA受體的特性，并為臨床治療有毒Hp菌株感染提供新的思路。1．幽門螺桿菌液體培養(yǎng)上清中VacA毒素的粗提： 選擇兩種不同的布氏肉湯成分TSB及MHB，加入不同的支持劑小牛血清(FBS)及CD，組成4組液體培養(yǎng)基TSB＋FBS，TSB＋CD，MHB＋FBS及MHB＋CD。刮取HpCCUG17874菌落至液體培養(yǎng)基中，于37℃微需氧環(huán)境150rpm振蕩培養(yǎng)72h，于培養(yǎng)前后分別檢測細菌濁度。結果顯示TSB＋CD組3天后細菌密度達10.33±1.76×10~8CFU／ml，低于TSB+FBS組(13.17±1.15)，但差異不顯著。二者培養(yǎng)前后的濁度比及菌體濕重均顯著高于以MHB為培養(yǎng)基組 第二軍醫(yī)大學 博士學位論文 中文初要 沖叼．of）。ii培養(yǎng)基組內加入不同支持物（CD或FBS）時，Hp 擴增效果相差不顯著0列．05）。通過50％飽和度的硫鞭沉淀4組 培養(yǎng)液上清中的蛋白，并經(jīng) 10mmol幾 PB緩沖液透析及濾膜離心后 制成 Hp上清濃縮液。LOWry七法測得 250pl濃縮上清內蛋白含量， TSB＋CD組蛋白濃度平均為 2．4410．39 m令ml，顯著高于 ii＋CD組 （0．52 10．19mg／ffil，P＜0．of人含 FBS組蛋白濃度較高。各組樣品 SDS－PAGE電泳結果顯示含HB組Hp上清濃縮液中均可見清晰的 95kDa條帶（VacA），但其中以 FBS為支持物組蛋白條帶數(shù)量多， 尤以 66ica條帶明顯。PX CD為支持物組可見 10余條帶，大部分位 于 66ma kX T。kX ii為培養(yǎng)基組均來見 95ica的靶片段，且蛋白 條帶較TSB組明顯減少。 將各組樣品經(jīng)倍比稀釋后與胃癌SGC刁9＊細胞共同孵育24h， 空泡活性觀察結果顯示空泡均位于核周胞漿內，大小不均，布滿整個 胞漿。TSB－CD組及HB＋FBS組樣品產(chǎn)生空泡明顯，于 1：5滴度 空泡形成細胞均達 100％，空泡比例隨毒素滴度遞減，而以 ii為 培養(yǎng)基組濃縮上清液無明顯空泡活性。NRU于550urn檢測光吸收值 （A。，。），TSB＋FBS組各滴度（1：5－l：40）及 TSB＋CD組各酒度 門：5～1：ZO）均產(chǎn)生明顯的空泡活性。兩組均以1：5滴度時山扣最高， TSB＋FBS組為 0．68t0．07，高于％B＋CD組（0．5410．09），但差異不 顯著（P＞0．05）。且兩組均隨毒素滴度的降低呈現(xiàn)明顯的遞減趨勢。 結果表明，TSB＋CD培養(yǎng)基液體培養(yǎng)的效果較好，可以代替含血清培 養(yǎng)基用于Va。A蛋白的分離純化。 采用TSB＋CD組濃縮上清，觀察孵育時間長短對空泡毒性的影 響，結果表明空泡活性具有明顯的時間依賴性。當毒素滴度為1：2時， 孵育 4h即產(chǎn)生明顯空泡（A”。＝0．43L0刀6），至 16h達最高吸收值（A”。 ＝0．71 10．03），至 24h時因細胞大量死亡，A。。。反而下降。l：5毒素滴 度的時間曲線較1：2滴度更恰當反應出空泡活性隨孵育時間變化的特 －2－ 第二軍醫(yī)大學 博士學位論文 中文摘要 性。NRU對空泡的判斷與細胞計數(shù)法基本符合，且 1：40滴度組空泡 細胞比例為 0．8土0．3％（－＊但 NRU檢測結果顯示 A55。＝0＊ 2土0＊4， 與空白對照相比仍有顯著差異（P＜0刀5）。結果表明，NRU較細胞計 數(shù)法有更高的敏感性，且有助于空泡活性的定量評價。 2．Va“毒素的純化： 地濃縮上清進一步采用吸附層析、疏水層析、陰離子交換層析 及撇過濾方法進行 VacA蛋白的純化。由幾 培養(yǎng)液中提取的蛋白 透析樣品 sml上樣于羥基磷灰石柱，流速 0．35 mlimin，分 lmlj管收 集，經(jīng) 10。Oil PB洗脫出現(xiàn)A、B兩峰，A峰最高吸收值達278llLAU， B峰最高達 252帆U。再以 10。OI／L－400。Oil PB不連續(xù)梯度洗 脫時出現(xiàn) C峰，吸收值為 15haU。經(jīng) N’RU檢測空泡活力存在于 A 峰。共收集A峰樣本約sml，予以 50％飽和度的硫鞭沉淀蛋白， 經(jīng) 60nunol／L Tis（pH7．7）緩沖液透析。再上樣于Phellylsepharose CL＊B疏水層析柱，用含0．5 mol幾則幾迢O。的 60nunol／L Tis洗脫， 出現(xiàn) A峰，最高吸收值 124haU，繼續(xù)予以 60mOI／L TriS洗脫出 B
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：R378

【共引文獻】

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本文編號：2773374