【摘要】：背景:在當(dāng)前醫(yī)學(xué)界,細(xì)菌感染性疾病仍然占有全世界的第一位的發(fā)病率,極大地威脅著人們的身體健康安全。目前細(xì)菌感染的表現(xiàn)也呈現(xiàn)著多樣化的形式,不僅僅局限于經(jīng)典意義上的感染和炎癥,而是出現(xiàn)包括器官移值后感染、慢性感染、感染后細(xì)胞惡性改變、感染后冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、HIV等后天性免疫系統(tǒng)抑制性感染、細(xì)菌耐藥性感染、機(jī)會(huì)致病菌的感染等等許多表現(xiàn)形式。尤其應(yīng)該指出的是,在當(dāng)前醫(yī)學(xué)治療中普遍存在的抗生素泛濫應(yīng)用的現(xiàn)象,使得盡管抗生素不斷推陳出新,仍然解決不了細(xì)菌的耐藥問(wèn)題,反而加大了抗菌素的毒副作用。往往是一種新型抗生素臨床試用了一段較短的時(shí)間后,就發(fā)現(xiàn)有耐藥菌株的出現(xiàn),給臨床治療感染性疾病帶來(lái)了令人頭痛的難題。盡管全世界的很多科學(xué)家們都致力于這個(gè)問(wèn)題的研究,但目前對(duì)這種問(wèn)題還沒(méi)有一個(gè)較理想的解決辦法。自然抗菌多肽在地球上多種動(dòng)植物體內(nèi)都廣泛性的存在,從植物的種子到低等無(wú)脊椎動(dòng)物,一直到人類的體內(nèi)都存在著這類結(jié)構(gòu)上具有高度保守性結(jié)構(gòu)的抗菌多肽。人防御素是其中非常重要的一類天然抗菌性多肽。它們是生物體在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中演化出來(lái)的一類與以往的抗生素不同的高效廣譜抗菌性多肽,而且有成分天然,取之于人可用之于人,不易引起毒副作用和細(xì)菌耐藥等問(wèn)題的特點(diǎn)。因此是一種新型具有臨床應(yīng)用前景的抗菌性藥物。另外,這類天然防御素的基因表達(dá)調(diào)控也與傳統(tǒng)的抗生素不同,使由單基因進(jìn)行表達(dá)的,因而使得轉(zhuǎn)基因的治療方法就成為可能,目的:1997年發(fā)現(xiàn)的人β防御素2(HBD-2)是首次發(fā)現(xiàn)的可誘生性的人防御素,對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和支原體都有具有強(qiáng)效廣譜的殺滅作用。本研究目的是嘗試構(gòu)建HBD-2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并從分子、蛋白、免疫、組織工程模型和動(dòng)物模型等方面對(duì)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行檢測(cè)。方法:利用限制性酶切、低溶點(diǎn)瓊脂糖電泳、核酸分子去磷酸化等分子克隆技術(shù)構(gòu)建并擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBabeNeo-HBD-2,結(jié)合Lipofectin法對(duì)多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。用ELISA法檢測(cè)HBD-2生成情況;提取細(xì)胞的mRNA,并制備p~(32)標(biāo)記探針進(jìn)行Northem Blot雜交,檢測(cè)HBD-2的mRNA表達(dá):利用CM Extraction和ZipTip技術(shù)由細(xì)胞培養(yǎng)液提取HBD-2,利用AU膠和Geloverlay技術(shù)檢測(cè)生物學(xué)活性;利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)其免疫學(xué)活性;建立離體組織工程模型和SCID小鼠在體模型檢測(cè)其抗菌生物學(xué)活性;并利用ELISA和RT-PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞生物學(xué)功能進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:成功構(gòu)建pBabeNeo-HBD-2載體,并從分子、細(xì)胞、蛋白質(zhì)和免疫學(xué)等多個(gè)水平角度證明了HBD-2基因在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功,并可轉(zhuǎn)錄為mRNA,并表達(dá)合成HBD-2分子。而且無(wú)論在分子大小,電泳能力,抗菌活性,還是與抗體的特異性結(jié)合方面,都與標(biāo)準(zhǔn)的HBD-2是一致的。在離體和載體模型也顯示其具有抗菌活性。結(jié)論:本研究在世界上首次對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行HBD-2轉(zhuǎn)基因的嘗試,結(jié)果證明利用新構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體成功地對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染,并且合成的HBD-2分子與標(biāo)準(zhǔn)的提取自人體組織的HDB-2是一致的,給今后對(duì)HBD-2的研究利用,以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在器官移植后抗感染增強(qiáng)免疫能力等領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟了一條新的途徑,具有非常重要的研究和應(yīng)用意義。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2772346