【摘要】：金黃色葡萄球菌(金葡菌)是人類主要的病原菌,它能引起肺炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等多種感染性疾病。隨著各種廣譜抗菌藥物在臨床的大量不合理使用,導(dǎo)致金葡菌對抗生素高度耐藥,造成臨床治療上的困難及病死率增高,嚴(yán)重威脅人類健康。因此,在合理使用抗生素的同時,也迫切需要開發(fā)與傳統(tǒng)抗生素作用模式不同的新型抗菌藥物。 溶葡萄球菌酶是一種由模仿葡萄球菌分泌的肽聚糖水解酶,能高效裂解金葡菌細(xì)胞壁。目前,它作為新型抗菌劑已進(jìn)入臨床研究用于治療創(chuàng)面金葡菌感染。該酶由兩個結(jié)構(gòu)域組成：N-端催化結(jié)構(gòu)域(催化區(qū))和X-端細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(結(jié)合區(qū))。在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)中,目前只有上述兩個結(jié)構(gòu)域同源類似物的晶體結(jié)構(gòu),即LytM(金葡菌分泌的一種自溶酶)的催化區(qū)(PDB:2B13)和ALE-1(頭狀葡萄球菌分泌的一種肽聚糖水解酶)的結(jié)合區(qū)(PDB:1R77),它們與溶葡萄球菌酶的催化區(qū)和結(jié)合區(qū)分別具有63%和89%的相似性。然而,至今還未見溶葡萄球菌酶晶體結(jié)構(gòu)的報道。 為了研究溶葡萄球菌酶如何高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖,我們展開了系列研究。首先,分別表達(dá)和純化溶葡萄球菌酶及其兩個結(jié)構(gòu)域,并且檢測了它們的生物活性,發(fā)現(xiàn)單獨催化區(qū)在低鹽濃度下具有很強的溶菌活性,但其活性隨離子強度的上升而顯著下降,當(dāng)環(huán)境中NaCl濃度提高至50mM時,它的溶菌活性只有原來的1%；然而全長溶葡萄球菌酶的溶菌活性受離子強度的干擾非常�。粏为毥Y(jié)合區(qū)具有與金葡菌非常強的親和力,與催化區(qū)不同的是,即使在生理鹽濃度(150mM NaCl)下,結(jié)合區(qū)還保持很強的親和力,說明結(jié)合區(qū)和催化區(qū)的組合可以顯著提高溶葡萄球菌酶的溶菌活性,并耐受環(huán)境(比如鹽離子)的影響。 為進(jìn)一步了解兩個結(jié)構(gòu)域是如何組合在一起發(fā)揮高效溶菌活性,我們用同源模建的方法,構(gòu)建了溶葡萄球菌酶催化區(qū)和結(jié)合區(qū)的三維結(jié)構(gòu)模型,并通過蛋白-蛋白分子對接方法,計算預(yù)測溶葡萄球菌酶兩個結(jié)構(gòu)域之間的對接方式,發(fā)現(xiàn)在自由能最低的前20個結(jié)構(gòu)中,溶葡萄球菌酶兩個結(jié)構(gòu)域之間沒有特定的相互作用界面,催化區(qū)隨機分布在結(jié)合區(qū)的各個方位,說明計算方法并不適合預(yù)測溶葡萄球菌酶兩個結(jié)構(gòu)域之間對接模型。 隨后,我們用實驗的方法鑒定溶葡萄球菌酶兩個結(jié)構(gòu)域之間的相互作用界面,應(yīng)用氫氘交換質(zhì)譜法比較全長溶葡萄球菌酶和它兩個結(jié)構(gòu)域之間氫氘交換率的變化,發(fā)現(xiàn)了4個肽段(aa.331-339、248-260、454-473和474-488)的氫氘交換率在全長溶葡萄球菌酶中變慢,表明這些肽段可能參與溶葡萄球菌酶兩個結(jié)構(gòu)域之間相互作用界面的形成。為了驗證哪些肽段確實參與界面的形成,我們通過位點特異二硫鍵交聯(lián)方法分析肽段之間的交聯(lián)反應(yīng),發(fā)現(xiàn)有兩個雙半胱氨酸突變體(K332C/T464C和K336C/T464C)能夠很好的形成二硫鍵,它們的突變位點分別位于肽段331-339(催化區(qū))和肽段454-473(結(jié)合區(qū))上,證明這兩個肽段在全長溶葡萄球菌酶分子中緊靠在一起,說明溶葡萄球菌酶的兩個結(jié)構(gòu)域在溶液中通過這兩個肽段相互作用形成了結(jié)構(gòu)域之間的界面,此時催化區(qū)和結(jié)合區(qū)的活性中心處于同一個平面,有利于它們同時與底物結(jié)合。 為了研究二硫鍵的形成對突變體(結(jié)構(gòu)域之間受到限制)生物活性產(chǎn)生的影響,我們比較了突變體(K332C/T464C)和野生型溶葡萄球菌酶與金葡菌細(xì)胞壁的親和力以及它們的溶菌活性。發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)受限的突變體與金葡菌細(xì)胞壁的親和力沒有改變,然而溶菌活性顯著下降,尤其是在高鹽環(huán)境下。為了確認(rèn)是二硫鍵產(chǎn)生的影響,我們用DTT打開突變體分子中的二硫鍵,消除兩個結(jié)構(gòu)域之間的限制,發(fā)現(xiàn)它的溶菌活性又完全恢復(fù),提示溶葡萄球菌酶兩個結(jié)構(gòu)域之間在一定范圍內(nèi)可以相對運動是該酶高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的一個重要因素。 之前研究人員已經(jīng)證明肽聚糖是一個具有彈性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),在不同離子強度條件下可以收縮或者伸展。當(dāng)環(huán)境鹽濃度升高,細(xì)菌細(xì)胞壁收縮,肽聚糖變得松散和無規(guī)則,溶葡萄球菌酶兩個結(jié)構(gòu)域之間的動力學(xué)特點可以幫助催化區(qū)迅速調(diào)整位置,結(jié)合并水解細(xì)胞壁上的底物,從而實現(xiàn)高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁。 本研究有助于我們更好地理解溶葡萄球菌酶高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的作用機制。根據(jù)獲得的結(jié)構(gòu)信息,進(jìn)一步可以選擇合適的位點進(jìn)行聚乙二醇修飾,獲得具有良好體內(nèi)藥效學(xué)和藥代動力學(xué)性質(zhì)的聚乙二醇化溶葡萄球菌酶,從而擴大臨床應(yīng)用范圍和提高療效。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.11
【圖文】：

Baba等I26】研究表明溶葡萄球菌酶分子中C-端結(jié)合區(qū)，可以將溶葡萄球菌酶特異性祀向金葡菌（圖1.5)，對該酶特異性識別金葡菌起到關(guān)鍵的作用。進(jìn)一步研究表明，溶葡萄球菌酶的結(jié)合區(qū)只結(jié)合處于交聯(lián)狀態(tài)下的五甘氨酸肽鍵橋Gargis等丨28】研究表明金葡菌細(xì)胞壁肽聚糖五甘氨酸肽鍵橋的突變并沒有完全抑制結(jié)合區(qū)與金葡菌的結(jié)合。這些研究結(jié)果表明溶葡萄球菌酶結(jié)合區(qū)祀向金葡菌細(xì)胞依賴于細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的多個結(jié)構(gòu)元素。目前溶葡萄球菌酶的晶體結(jié)構(gòu)依然沒有獲得，它的高效溶菌機制和特異性IE向機制還有待進(jìn)一步研究。?Gn_Mu -Gn—Mu -Gn—Mu—GnA/IL-AlaID-iGInI ^L-Lys i i D-Ala “I i 1 I iD-A!a—Gly Gly Gly Gly Gly _L-Lys ^(cross-bridge) ■ 芒D-iGIn，I —?i CLL嚴(yán)?Gn—Mu -Gn—Mu "-Gn—Mu "<3nA/(Polysaccharide chain)圖1. 4金葡菌肽聚糖的主要成分和溶葡萄球菌酶的作用位點(箭頭標(biāo)示)示意圖3

）) (PDB: 1R77)(圖i.iob)。CAT結(jié)構(gòu)域的活性中心由一個狹長的四槽WT結(jié)構(gòu)域?qū)儆诩?xì)菌SH3b家族，負(fù)責(zé)細(xì)菌細(xì)胞壁的識別，研究人員通過突變分析了它的活性中心區(qū)域11()3]。

圖1.10a金葡菌自溶酶LytM催化區(qū)的 圖1. 10b頭狀葡萄球菌肽聚糖水解酶晶體結(jié)構(gòu) ALE-1細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)的晶體結(jié)構(gòu) CAT domain Lysostaphin 248 :AATHeHSAQm:*mYKRO7(3YGP7FLGXNG0MHY<3VDFFMtT工(3rFVKAZSSGKXVEA0WSIT709(aVQI<aLIS3DaVHRQWXMHI*Sl^Ale-1 119 ： AAQS2!mSASWI^THYKKG3:SYGpyPI>GXNOramYGrVDFn4MVI3TFVKAISDOKXVEACIVmTZOOarEiaLVENDSVHRQWXHKLSKLytM 182 : ASGHAKDASWI.TSKKQI.QPYOQ'THG OaAHXGFVDYAMPEHSEVXSLTDGTWQAGKSNYOGaNQVTIKEANSinTYQWZMHNITR? * * * * ； * * ** *?*■** ： ? I ** * ；*；*** ****** * ***** Linker %

本文編號：2754937