【摘要】：目的：破骨細(xì)胞是骨吸收的主要功能細(xì)胞,由造血系統(tǒng)的單核-巨噬細(xì)胞系分化而來,在生理和病理性骨代謝中發(fā)揮著重要的作用。許多疾病狀態(tài)下,破骨細(xì)胞的形成和功能受到影響,導(dǎo)致骨吸收異常的病理狀態(tài)。體內(nèi)破骨細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜的過程,其機(jī)制尚未完全明了。以刺激因子體外誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化是研究破骨細(xì)胞分化機(jī)制的有效方法,本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)原代小鼠骨髓單核細(xì)胞,并以不同濃度刺激因子誘導(dǎo),建立后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)用的小鼠原代骨髓單核細(xì)胞(BMMs)體外培養(yǎng)體系。 方法：取小鼠原代全骨髓細(xì)胞,在含有50ng/ml M-CSF的骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)基中37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h,利用差異貼壁方法去除骨髓基質(zhì)細(xì)胞,取未貼壁的細(xì)胞懸液,再利用單核細(xì)胞分離液分離出純度較高的骨髓單核細(xì)胞。以不同濃度RANKL體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化,于不同時(shí)間點(diǎn)觀察各組細(xì)胞分化狀態(tài),培養(yǎng)72h時(shí)終止誘導(dǎo),行TRAP染色,觀察比較誘導(dǎo)終點(diǎn)時(shí)不同濃度RANKL誘導(dǎo)組破骨細(xì)胞分化程度及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。 結(jié)果：分離所得骨髓單核細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),均勻分布,形態(tài)較為均一,多為圓形、多角形,少數(shù)為長(zhǎng)梭形,細(xì)胞體積較小。本實(shí)驗(yàn)采用50ng/ml M-CSF及兩種濃度小鼠重組RANKL分別誘導(dǎo):1ng/ml和lOng/ml。結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)早期(24h),兩組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)大致相同,形態(tài)較為均一,細(xì)胞多為圓形及多角形,少量單核細(xì)胞呈TRAP染色陽(yáng)性,均未見多核細(xì)胞生成。兩組細(xì)胞均于誘導(dǎo)48h開始出現(xiàn)體積較小的TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞,形態(tài)、體積及數(shù)目無明顯差異。直至誘導(dǎo)晚期(72h),兩組細(xì)胞分化狀態(tài)才出現(xiàn)區(qū)別：10ng/mlRANKL刺激組TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞數(shù)量更多、體積更大,胞漿更為伸展；而1ng/mlRANKL刺激組TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞體積則比較小,形狀多為毛刺狀或油烈蛋樣。 結(jié)論：M-CSF的作用下全骨髓細(xì)胞于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí),此時(shí)收集未貼壁細(xì)胞,是利用BMMs在M-CSF作用下貼壁時(shí)間長(zhǎng)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞而進(jìn)行的第一次純化,將收集的未貼壁細(xì)胞經(jīng)過單核細(xì)胞分離液梯度離心半小時(shí),根據(jù)不同細(xì)胞密度的差異,取中間部分白膜層進(jìn)行單核細(xì)胞第二次純化,用此方法便可以分離出形態(tài)較為均一、純度較高的骨髓單核細(xì)胞,可用于后續(xù)試驗(yàn)。在50ng/mlM-CSF條件下,高濃度(10ng/ml)RANKL較低濃度(1ng/ml)RANKL刺激組誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成能力更強(qiáng),可以增加破骨細(xì)胞生成的數(shù)量、體積,并可能提高其骨吸收能力,但是并不能加快誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的速度。后續(xù)試驗(yàn)可選用1ng/ml RANKL及50ng/ml M-CSF體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。 目的：骨穩(wěn)態(tài)一旦被破壞,便會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。骨吸收功能亢進(jìn)可導(dǎo)致骨質(zhì)破壞,骨密度降低,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等,這些疾病大多伴隨有血清或骨關(guān)節(jié)局部腫瘤壞死因子(TNF-a)的增高。高水平TNF-α)與全身或局部性骨丟失疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系,可直接或間接的促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成及功能,但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。近年來體外研究證明,TNF-α不直接影響RANK/RANKL近端激活的分子,而是可能通過活化破骨前體細(xì)胞內(nèi)鈣離子震蕩,增強(qiáng)NFATc1自放大作用來促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。體內(nèi)參與該震蕩調(diào)控的分子眾多,TNF-α是通過何種機(jī)制實(shí)現(xiàn)其對(duì)鈣離子震蕩的調(diào)控作用呢?以往文獻(xiàn)報(bào)道,ROS和PC-PLC是細(xì)胞內(nèi)位于多種TNF-α信號(hào)通路下游同時(shí)參與介導(dǎo)鈣振蕩形成的兩種重要信號(hào)分子,介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞事件的發(fā)生。IP3受體是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的一種鈣離子通道,通過結(jié)合IP3而活化,介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)和細(xì)胞質(zhì)之間的鈣離子交通,是細(xì)胞內(nèi)鈣震蕩波形成的重要通道。至今研究發(fā)現(xiàn)主要存在3種IP3受體亞型：IP3R1、IP3R2和IP3R3,其分布有組織和細(xì)胞類型特異性。研究顯示,小鼠破骨前體細(xì)胞中同時(shí)存在上述三種IP3受體。本部分實(shí)驗(yàn)旨在探討ROS、PC-PLC及IP3Rs在TNF-a對(duì)鈣離子震蕩調(diào)控過程中的作用,進(jìn)一步揭示TNF-α促進(jìn)體內(nèi)外破骨細(xì)胞生成的機(jī)制。 方法：本研究采用第一部分實(shí)驗(yàn)中建立的破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,以1ng/ml RANKL和50ng/ml M-CSF誘導(dǎo)小鼠骨髓來源單核細(xì)胞,在誘導(dǎo)過程中加入3ng/ml TNF-α刺激。使用DCFH-CA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)ROS水平變化,明確ROS在RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中的變化趨勢(shì)及加入TNF-α刺激后細(xì)胞內(nèi)ROS的變化情況；采用磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)特異性抑制劑D609探討PC-PLC在TNF-α促進(jìn)體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成中的作用。將培養(yǎng)細(xì)胞分為誘導(dǎo)對(duì)照組、TNF-α刺激組、D609刺激組及TNF-a+D609刺激組四組,施加不同誘導(dǎo)及刺激因子。于培養(yǎng)48h時(shí),激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各刺激組細(xì)胞內(nèi)鈣離子的震蕩情況,明確各刺激因素對(duì)鈣振蕩的影響效果；RT-PCR及western blotting檢測(cè)不同處理組三種IP3Rs mRNA及蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步闡述IP3Rs在TNF-α促進(jìn)RANKL體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成過程中的作用。 結(jié)果：研究中發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)ROS水平在RANKL誘導(dǎo)24h開始升高,并持續(xù)至48h以后,加入TNF-a不能使細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)一步升高；比較各組TRAP染色陽(yáng)性多核細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn),磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)特異性抑制劑D609抑制了TNF-α對(duì)破骨細(xì)胞生成的促進(jìn)作用,但是對(duì)RANKL單獨(dú)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成并無抑制,相反輕度促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。TNF-α能夠明顯增強(qiáng)小鼠骨髓來源單核細(xì)胞中鈣離子通道IP3R1mRNA和蛋白的表達(dá),而不影響IP3R2和IP3R3mRNA水平,提示位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子通道IP3R1的上調(diào)可能為其配體IP3提供更多的結(jié)合位點(diǎn),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣震蕩的產(chǎn)生,IP3R1參與TNF-a對(duì)RANKL體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的促進(jìn)作用,而IP3R2和IP3R3可能并不參與介導(dǎo)該過程。D609抑制了TNF-a對(duì)IP3R1mRNA和蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用,降低鈣離子震蕩水平,進(jìn)而抑制NFATc1活化,同時(shí)消除了TNF-α對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響。上述結(jié)果表明PC-PLC及IP3R1可能參與TNF-α促進(jìn)破骨細(xì)胞生成的過程之中。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了TNF-α不直接影響RANK/RANKL近端激活的分子,ROS可能介導(dǎo)破骨細(xì)胞體外分化,但不參與TNF-α對(duì)RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的促進(jìn)作用；TNF-α能夠通過活化PC-PLC,上調(diào)IP3R1mRNA和蛋白的表達(dá)水平,促進(jìn)破骨前體細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)與細(xì)胞漿之間的鈣交通,以增強(qiáng)其鈣離子震蕩,促進(jìn)NFATc1活化和自放大,最終促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉華清;李冰燕;張?jiān)隼?;四種小鼠破骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法的比較[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué);2011年09期

本文編號(hào)：2754410