【摘要】：國際疼痛研究協(xié)會將神經(jīng)病理性疼痛定義為在外周或中樞水平由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛。神經(jīng)病理性疼痛嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，治療困難，給社會帶來巨大的衛(wèi)生資源壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。近年來國內(nèi)外對神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制已進(jìn)行了大量研究并取得了一定的進(jìn)展。目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生及維持涉及神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性，包括外周及中樞機(jī)制，但是確切機(jī)制尚未闡明。越來越多的證據(jù)表明，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的脊髓膠質(zhì)細(xì)胞在慢性疼痛特別是神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展、維持過程中發(fā)揮著重要的作用，因此研究和發(fā)現(xiàn)影響膠質(zhì)細(xì)胞激活的分子對于解釋神經(jīng)病理性疼痛的生物學(xué)機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)靶點(diǎn)和治療措施具有十分重要的意義。 水通道4（aquaporin4, AQP4）是參與水轉(zhuǎn)運(yùn)的水通道家族中的一員，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最豐富的水通道。在腦內(nèi)AQP4呈典型的極性分布，主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞與血管相連的終足上，同時在室管膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上也有表達(dá)；在神經(jīng)元中幾乎不表達(dá)；在靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞上不表達(dá)，激活態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞上是否表達(dá)尚存在爭議。在脊髓中，AQP4主要分布于圍繞興奮性和抑制性突觸結(jié)構(gòu)的星形膠質(zhì)細(xì)胞突起部位，提示其可能參與突觸傳遞功能。AQP4在脊髓背角中的分布從淺層到深層逐漸降低，在背角淺層（I、II層）表達(dá)最高，提示可能與脊髓背角淺層的功能密切相關(guān)。文獻(xiàn)調(diào)研顯示，AQP4是星形膠質(zhì)細(xì)胞上最重要的水通道，能夠影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間隙連接；能夠調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能，影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移、增殖以及瘢痕的形成。此外，AQP4與鉀通道4.1（Kir4.1）和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（glutamate transporter1, GLT1）共存于星形膠質(zhì)細(xì)胞中，在功能上存在偶聯(lián)，對于細(xì)胞外K+穩(wěn)態(tài)的維持以及突觸間隙谷氨酸的清除非常重要。AQP4還通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能，包括調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性、多巴胺（dopamine，DA）、谷氨酸（glutamate，Glu）等神經(jīng)遞質(zhì)的含量及釋放和某些病理條件下神經(jīng)元存活和神經(jīng)再生，但詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。近年來大量研究報道星形膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)病理性疼痛。最近研究顯示，損傷、缺血誘發(fā)的腦內(nèi)AQP4表達(dá)上調(diào)與星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表達(dá)上調(diào)相平行，而下調(diào)AQP4表達(dá)則影響堿性成纖維細(xì)胞生長因子刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖；AQP4基因敲除能夠降低腦內(nèi)注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）引起的神經(jīng)炎癥，也能夠降低培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中LPS刺激的前炎性細(xì)胞因子的釋放。以上研究提示，AQP4可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能密切相關(guān)，但是AQP4是否參與神經(jīng)病理性疼痛目前尚未見報道。因此，本課題的目的是研究AQP4在神經(jīng)病理性疼痛中的作用及可能機(jī)制。 本課題的研究內(nèi)容主要包括以下三部分：第一部分，在小鼠急性疼痛模型和大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中給予AQP4非選擇性抑制劑乙酰唑胺（acetazolamide,AZA），初步研究AQP4在急性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛中的作用。結(jié)合本課題組在AQP4基因敲除動物中的研究結(jié)果，在明確了AQP4在神經(jīng)病理性疼痛中的作用后，第二部分，應(yīng)用野生型和AQP4基因敲除小鼠構(gòu)建坐骨神經(jīng)分支損傷模型(spared nerve injury, SNI）模型，研究神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中脊髓AQP4表達(dá)的時程特征及其與星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)系。明確AQP4與膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)系后，第三部分研究哪些刺激膠質(zhì)細(xì)胞激活的因素依賴于AQP4，即在細(xì)胞水平從膠質(zhì)細(xì)胞激活方面探討AQP4影響了哪些刺激膠質(zhì)細(xì)胞激活的因素。通過以上研究，探討AQP4參與神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制。具體研究結(jié)果如下： 一、AQP4非選擇性抑制劑乙酰唑胺對急性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛的作用：AQP4非選擇性抑制劑AZA對熱刺激（熱輻射甩尾和熱板模型）誘發(fā)的小鼠急性疼痛無顯著影響，但是AZA可劑量依賴的減輕大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury, CCI）模型機(jī)械刺激痛覺超敏。本課題組尚未發(fā)表的實(shí)驗結(jié)果表明AQP4基因敲除對熱刺激（熱板和熱輻射甩尾模型）、化學(xué)刺激（福爾馬林和辣椒素致痛模型）和機(jī)械刺激（von Frey hair模型）誘發(fā)的急性疼痛均無影響，但是能顯著減輕神經(jīng)病理性疼痛誘發(fā)的機(jī)械刺激痛覺超敏。這些實(shí)驗結(jié)果提示AQP4不影響急性疼痛，可能參與神經(jīng)病理性疼痛。 二、在神經(jīng)病理性疼痛中AQP4表達(dá)的時程特征及其與膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)系：行為學(xué)測試結(jié)果顯示，在小鼠SNI模型中，從術(shù)后1d到術(shù)后28d，AQP4基因敲除（knockout, KO）小鼠與野生型（wild-type, WT）小鼠相比機(jī)械刺激痛覺超敏的程度顯著減輕，提示AQP4在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮了作用。在此模型中，我們研究了脊髓中的AQP4在神經(jīng)病理性疼痛中表達(dá)的時程特征及其與膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)系。蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示，在WT小鼠中，與假手術(shù)組相比，SNI手術(shù)組小鼠脊髓（L4-L6節(jié)段）中AQP4的表達(dá)在術(shù)后1d和3d無顯著變化，而在術(shù)后7d開始出現(xiàn)顯著升高，該現(xiàn)象至少持續(xù)至術(shù)后28d；GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)上調(diào)反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活）的表達(dá)和表達(dá)的時程改變與AQP4完全一致；簇分化抗原11b（Cluster differentiation antigen11b, CD11b,小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，其表達(dá)上調(diào)反映了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活）的表達(dá)則在術(shù)后1d就出現(xiàn)明顯升高并持續(xù)至術(shù)后7d，之后開始降低，術(shù)后28d時已恢復(fù)至正常水平。在AQP4KO小鼠中，與假手術(shù)組相比，SNI手術(shù)組小鼠脊髓中GFAP的表達(dá)在術(shù)后1d到術(shù)后28d均未出現(xiàn)明顯改變；CD11b的表達(dá)在術(shù)后1d和3d未出現(xiàn)顯著性升高。術(shù)后7d開始降低，術(shù)后14d時已恢復(fù)至正常水平。這些結(jié)果提示，在神經(jīng)病理性疼痛早期，AQP4的表達(dá)沒有改變，星形膠質(zhì)細(xì)胞也沒有激活，但此時小膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)激活；而在神經(jīng)病理性疼痛中晚期，AQP4表達(dá)增強(qiáng)，此時星形膠質(zhì)細(xì)胞也處于激活狀態(tài)，但小膠質(zhì)細(xì)胞的激活開始降低并恢復(fù)至正常水平。以上結(jié)果說明星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和AQP4的表達(dá)升高具有相關(guān)性，而小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和AQP4的表達(dá)升高的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。因此，AQP4基因敲除減輕神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制可能與其抑制脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。 在神經(jīng)病理性疼痛中，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均能夠釋放前炎性細(xì)胞因子，如白介素1beta（interleukin-1β, IL-1β）、白介素6（interleukin-6, IL-6）和腫瘤壞死因子alpha（tumor necrosis factor-, TNF-），這些因子反映了膠質(zhì)細(xì)胞激活后的功能變化。在WT小鼠中，與假手術(shù)組相比，SNI手術(shù)組小鼠脊髓（L4-L6節(jié)段）中IL-1β、IL-6和TNF-的含量在術(shù)后1、3、7、14和28d均顯著升高，與膠質(zhì)細(xì)胞的激活相一致；在AQP4KO小鼠中，與假手術(shù)組相比，SNI手術(shù)組小鼠脊髓中上述3種因子的含量在術(shù)后1d和3d未出現(xiàn)顯著性升高，從術(shù)后7d開始3種因子的含量恢復(fù)至正常水平。結(jié)果提示，在神經(jīng)病理性疼痛早期，3種因子的來源主要是激活的小膠質(zhì)細(xì)胞；而在神經(jīng)病理性疼痛中晚期，3種因子的來源主要是激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞。因此，在神經(jīng)病理性疼痛中晚期，AQP4基因敲除能夠降低脊髓中前炎性細(xì)胞因子的含量。 綜上所述，本部分研究發(fā)現(xiàn)AQP4基因敲除減輕神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制可能與其抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活、降低前炎性細(xì)胞因子的含量有關(guān)；與小膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系有待進(jìn)一步有研究。 三、AQP4對膠質(zhì)細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)及機(jī)制：本課題的第二部分在整體水平上觀察到了AQP4與星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)系，而AQP4又表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞上，那么AQP4是否直接影響了星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活？因此本部分研究用體外實(shí)驗來回答這個問題。神經(jīng)病理性疼痛中（如SNI模型），前炎性細(xì)胞因子和致痛遞質(zhì)是兩個很重要的引起膠質(zhì)細(xì)胞激活的刺激因素，在本部分的研究中，用LPS刺激膠質(zhì)細(xì)胞模擬前炎性細(xì)胞因子引起的膠質(zhì)細(xì)胞的激活，用谷氨酸（glutamicacid, Glu）刺激膠質(zhì)細(xì)胞是致痛遞質(zhì)導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞激活的刺激因素。在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞模型上，通過免疫熒光實(shí)驗發(fā)現(xiàn)LPS（100ng/ml）能夠激活體外培養(yǎng)的大鼠乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞；而AQP4非選擇性抑制劑AZA（0.1μM、0.3μM、1μM、3μM和10μM）可以劑量依賴的抑制LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。此外，LPS（100ng/ml）可以引起AQP4表達(dá)陽性的WT乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而不引起AQP4表達(dá)陰性的KO乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。這些實(shí)驗結(jié)果說明LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活依賴于AQP4的存在。同時還發(fā)現(xiàn)Glu（10μM、100μM和1mM）能夠激活體外培養(yǎng)的大鼠乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞；而AZA（10μM）可以抑制上述3個濃度的Glu誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。此外，Glu（1mM）可以引起AQP4表達(dá)陽性的WT乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而不引起AQP4表達(dá)陰性的KO乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。這些實(shí)驗結(jié)果表明Glu誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活依賴于AQP4的存在。因此，體外實(shí)驗直接證實(shí)了AQP4的存在是星形膠質(zhì)細(xì)胞激活所必需的。 因此，本論文研究首次發(fā)現(xiàn)，AQP4不影響急性疼痛，但參與神經(jīng)病理性疼痛；其可能機(jī)制是通過直接影響脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及前炎性細(xì)胞因子的釋放實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【圖文】：

時還通過調(diào)節(jié)外周免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子數(shù)量的多5]。病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的學(xué)說有兩種，一種是傳一種是新的“膠質(zhì)細(xì)胞參與學(xué)說”。神經(jīng)元驅(qū)動學(xué)說”認(rèn)為，對強(qiáng)烈、持續(xù)傳入的傷害性經(jīng)元對傳入的信號變得過度敏感。而強(qiáng)烈、持續(xù)的痛鎂離子通過與 N-甲基天冬氨酸（N-methyl D asparta流出，從而導(dǎo)致鈣離子的流入，進(jìn)而激活了組成型表L-精氨酸轉(zhuǎn)化為一氧化氮（nitric oxide, NO）氣體。N擴(kuò)散出來，引起突觸前釋放大量的 P 物質(zhì)和興奮性氨起痛覺傳遞神經(jīng)元過度興奮，突觸傳遞功能增強(qiáng)，導(dǎo)致該過程是沒有膠質(zhì)細(xì)胞參與的[6]。但是該觀點(diǎn)只能夠痛覺過敏、痛覺超敏等現(xiàn)象，對自發(fā)性疼痛如鏡像痛象卻無法解釋。

接的糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的通路或神經(jīng)元介導(dǎo)的信號激活。激活的膠質(zhì)細(xì)胞能夠釋放多種神經(jīng)活性物質(zhì)和細(xì)胞因子，反過來作用于神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，引起神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞相互作用的放大回路。其中，前炎性細(xì)胞因子可以直接作用于突觸后神經(jīng)元，影響它們的興奮性；也可以參與調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，包括編碼 NMDA受體和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 1（Glutamate transporter 1, GLT 1）的基因。大量的神經(jīng)遞質(zhì)和前炎性細(xì)胞因子的釋放的匯集，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的下調(diào)，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的重攝取降低，最終導(dǎo)致了突觸后痛覺傳遞神經(jīng)元的敏感性和反應(yīng)性增強(qiáng)，促進(jìn)了中樞敏化的發(fā)生和維持[7]。因此，膠質(zhì)細(xì)胞的激活是神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生和維持的強(qiáng)大驅(qū)動力，通過神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞組成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)使疼痛信號得以放大和持續(xù)。而受損部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠?qū)⑿畔⑼ㄟ^鈣波傳遞給正常部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致該部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生與受損部位的細(xì)胞相同的作用，從而引發(fā)鏡像痛、無源痛以及區(qū)域外疼痛等癥狀[8-10]。雖然膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛中的作用已經(jīng)得到公認(rèn)，但其具體作用機(jī)制以及激活機(jī)制尚未完全闡明。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2716781