【摘要】： 經(jīng)典理論認為促性腺激素釋放激素(GnRH)是由下丘腦神經(jīng)元分泌的一種十肽激素，它經(jīng)下丘腦垂體門脈系統(tǒng)進入垂體前葉，與垂體前葉的促性腺激素分泌細胞上的促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)結(jié)合，刺激卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的分泌，進而調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育與配子的形成。近二十年的大量研究證據(jù)表明，GnRH及其受體廣泛存在于下丘腦-垂體軸之外，如生殖系統(tǒng)(卵巢、輸卵管、前列腺、睪丸以及胎盤等)、免疫系統(tǒng)(T、B淋巴細胞)和許多惡性腫瘤(如乳腺癌、肺癌、胰腺癌及肝癌)，通過自分泌和旁分泌途徑對這些組織器官以及惡性腫瘤的生長起調(diào)節(jié)作用。 我們先前的研究表明，在大鼠的消化系統(tǒng)廣泛地存在有GnRH及其受體，并且其受體的基因序列與垂體的基因序列一致，說明大鼠的消化系統(tǒng)能夠自身分泌與合成GnRH及其受體，同時這些組織或細胞是GnRH作用的靶細胞，如GnRH類似物可明顯促進大鼠 第四軍醫(yī)大學博士學位論文：大鼠胰腺促性腺激素釋放激素及其受體的研究 頜下腺神經(jīng)生長因子的分泌，還可明顯抑制大鼠胃酸的分泌。但 是大鼠胰腺是否存在GnRH及其受體，它們的基因序列如何，GnRH 對大鼠胰腺的功能有何影響，其受體的信號轉(zhuǎn)導機制怎樣，這些 問題均未見報道。 由此我們在以往研究的基礎(chǔ)上。進行了以下研究： 應用兔疫組織化學和原位雜交技術(shù)在胰腺組織切片上檢測 GnRH及其受體的定位及表達； 利用反轉(zhuǎn)錄PCR和基因克隆測序的方法對大鼠胰腺GnRH及其 受體的基因序列進行研究； 運用組織塊體外孵育法，用不同濃度GnRH類似物進行刺激， 同時借助ELISA、放免法等技術(shù)觀察在體外條件下GnRH對大鼠胰 腺內(nèi)、外分泌功能的影響； 借助活體動物實驗，由尾靜脈注射和十二指腸灌注兩種方式給 與GnRH類似物，留取血漿和十H指腸液，分別檢測胰腺內(nèi)、外分 泌功能指標的變化； 原代培養(yǎng)大鼠胰腺腺泡細胞，體外條件下給予GnRH類似物刺 激，應用細胞凋亡檢測試劑盒和流式細胞技術(shù)，觀察GnRH對大鼠 胰腺細胞凋亡的影響： 用ELISA、放免法、激光共聚焦技術(shù)和免疫組化染色技術(shù)等觀 察不同濃度GnRH類似物在不同時間內(nèi)對大鼠胰腺細胞胞內(nèi)cAMP、 MAPK、PKC、Ca卜、iNOS含量變化的影響。 通過實驗得到主要研究結(jié)果如下： 應用免疫組織化學和原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)，胰腺的外分泌部 部分細胞含有GnRH免疫反應陽性物質(zhì)，而胰島細胞未發(fā)現(xiàn)GnRH 免疫反應陽性物質(zhì)。同時胰島內(nèi)所有胰高血糖素免疫反應陽性的 4 第四軍醫(yī)大學博士學位論文：大鼠胰腺促性腺激素釋放激素及其受體的研究 細胞均呈GnRH受體免疫反應陽性，兩種陽性細胞的數(shù)量及分布特 點完全一致。原位雜交雜交結(jié)果顯示在胰腺內(nèi)、外分泌部均發(fā)現(xiàn) GnRHR覦NA雜交信號。結(jié)合以往研究發(fā)現(xiàn)胰腺外分泌部檢測到 GnRH mRNA雜交信號，我們認為胰腺外分泌部細胞能夠分泌GnRH， 而其受體分布于胰腺內(nèi)、外分泌部大部分細胞。 我們從大鼠胰腺提取總RNA，應用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法分別擴 增GnRH和GnRHR基因，并對產(chǎn)物進行純化回收，然后進行序列分 析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠胰腺GnRH基因序列與下丘腦的完全一致：而胰 腺GnRHR基因序列與垂體的完全一致。 應用不同濃度的GnRH類似物進行體外組織塊孵育，收集培養(yǎng) 上清液進行檢測發(fā)現(xiàn)，體外條件下，GnRH能明顯增加胰蛋白酶和 胰高血糖素的分泌，降低胰島素的分泌，并且具有明顯的濃度依 賴性。 體內(nèi)動物實驗中我們從尾靜脈和十二指腸兩種途徑給藥，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)：尾靜脈給藥能明顯增加胰蛋白酶和胰高血糖素的分泌， 降低胰島素的分泌；十二指腸給藥僅能增加胰蛋白酶的分泌，對 胰島素和胰高血糖素的分泌均無影響。 最后我們對GnRHR的信號轉(zhuǎn)導分子進行了研究，發(fā)現(xiàn)GnRH類 似物刺激胰腺細胞后，PKC活性的變化顯示明顯的時間和劑量依賴 性，其活性高峰出現(xiàn)在30min；cAMP水平變化里時間和劑量依賴 性，在個2小時含量變化最大，2小時達高峰：瞅瞅在短時間內(nèi) 即出現(xiàn)活性高峰，且其含量變化里劑量依賴性；i NOS的活性在整 個實驗過程中沒有出現(xiàn)明顯的變化；同時本實驗觀察＊”變化曲 線時可以看到延遲峰（膜上鈣通道開放所致）和瞬時峰（胞內(nèi)鈣 庫開放所致）均存在，推測胞內(nèi)＊“水平的提高有胞內(nèi)和胞外兩 5 第四軍醫(yī)大學博士學位論文：大鼠胰腺促性腺激素釋放激素及其受體的研究 種來源的＊”的參與，分別應用膜上二型鈣通道阻滯劑Lac i di…ne 和胞內(nèi)鈣庫阻滯劑Ryanodine的實驗進一步證明這一推測，即胞 內(nèi)C／“水平的提高既有通過膜上乙型鈣通道進入胞漿的＊“也有 通過胞內(nèi)鈣庫釋放進人跑漿的CaZ”的參與。由以上結(jié)果我們推測 大鼠胰腺GnRHR的信號轉(zhuǎn)導有叫C－Cd”途徑，同時還有cA慚、MAPK 的參與。 綜上所述，本研究首次在大鼠胰腺中發(fā)
【學位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R329
【圖文】：

純出一種哺乳類GnRH(mGnRH)以來，人們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了羊、大鼠、小鼠等哺乳類動物的mGnRH，并且發(fā)現(xiàn)其在分子結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性(圖1)。在King和Millar(1979)于非哺乳類脊椎動物腦中發(fā)現(xiàn)新的GnRH分子類型以前，人們一直認為GnRH的分子形式只有一種。在對非哺乳類脊椎動物的研究中，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些新的GnRH分子，它們長度相同，是由九種不同類型的氨基酸組成的十膚，含至少50%相同的氨基酸序列，結(jié)構(gòu)上它們的一COOH端和一NHZ端(第1，2，3

圖520一25Kb，GnRHR基因和轉(zhuǎn)錄單位結(jié)構(gòu)示意圖。GnRHR單拷貝基因長約由3個外顯子和2個內(nèi)含子構(gòu)成，各種屬間高源性較高。2.GnRHR的垂體外表達及調(diào)控研究表明，垂體組織中GnRHRmRNA的含量最高，其次為卵巢和翠丸，分別為40%和5%(Stojilkovie等，1994);近來人們采用RNA印記、RT一PCR、原位雜交和受體結(jié)合試驗分析表明，在大鼠、牛、羊和人等哺乳類動物的垂體中存在的GnRH自分泌調(diào)節(jié)機制。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)除下丘腦一垂體軸系以外，GnR!1及其受體均可存在于其它組織器官中。在生殖系統(tǒng)，經(jīng)RT一PCR及克隆測序等研究發(fā)現(xiàn)，GnRH及其受體存在于卵巢上皮細胞(Kang等，、en，;atwan，

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃威權(quán)，向正華，孟琳;促性腺激素釋放激素mRNA陽性細胞在大鼠胃腸胰系統(tǒng)的分布[J];解剖學報;1996年02期

本文編號：2716231