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葫蘆素E對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間：2017-03-27 17:17

本文關(guān)鍵詞：葫蘆素E對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：葫蘆素E（cucurbitacin E，CuE）是從葫蘆科屬植物中分離得到的四環(huán)三萜類天然化合物，具有廣泛的生物學(xué)活性,包括抗炎和抗腫瘤作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素類化合物具有改變多種腫瘤細(xì)胞形態(tài)，破壞細(xì)胞骨架，使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯的作用,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。但其抗炎機(jī)制尚沒有完全闡明。本研究以CuE為主，分析其對(duì)脂多糖（LPS）激活的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7表達(dá)的腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1）等炎癥反應(yīng)的影響，以及對(duì)MAPKs信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路蛋白活化和NF-κB的核轉(zhuǎn)位的作用，在細(xì)胞和分子水平探討其抗炎機(jī)制。方法 1.小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞置于含體積10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37C、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2.配置不同濃度的CuE（0.16mol/L、4mol/L、20mol/L、100mol/L）處理RAW264.7細(xì)胞48小時(shí)，用MTS方法檢測(cè)CuE對(duì)細(xì)胞存活的影響，，用吸光度為490nm的酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光率，從而計(jì)算細(xì)胞存活率和半數(shù)抑制率(IC50)，根據(jù)結(jié)果選擇合適藥物濃度。 3.不同濃度的CuE處理LPS活化的RAW264.7細(xì)胞12小時(shí)后，用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，拍照記錄。采用免疫印跡方法和蛋白定量方法檢測(cè)G-actin和F-actin的表達(dá)量，通過細(xì)胞免疫熒光染色方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)-actin的分布。 4.碘化丙錠（PI）染色法檢測(cè)LPS活化的RAW264.7細(xì)胞與不同濃度的CuE共同孵育24小時(shí)后的細(xì)胞周期變化。 5.用細(xì)胞因子染色法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析CuE對(duì)LPS活化的RAW264.7表達(dá)細(xì)胞因子TNF-α和IL-1的影響。 6.用免疫印跡法檢測(cè)MAPKs信號(hào)通路磷酸化蛋白(p-p38、p-JNK、p-ERK1/2)和NF-κB信號(hào)通路蛋白（p-IκB、p-p65、IκB、p65）的水平，以及NF-κB的核轉(zhuǎn)位的情況。結(jié)果： 1.不同濃度的CuE處理RAW264.7細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞增殖隨著CuE濃度的增加而減少，當(dāng)CuE濃度達(dá)到100mol/L時(shí)，細(xì)胞存活率只有16.540.70%。提示CuE對(duì)RAW264.7細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，計(jì)算得到CuE的IC50為7.79mol/L，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)藥物濃度的選擇提供了依據(jù)。 2．細(xì)胞形態(tài)觀察表明，LPS刺激RAW264.7細(xì)胞與對(duì)照組相比，細(xì)胞體積變大，偽足伸長(zhǎng)；加CuE后細(xì)胞變圓，偽足消失。 3.免疫印跡結(jié)果顯示，G-actin的蛋白含量隨著CuE的加入而減少，而在F-actin量則增多；免疫熒光顯示actin蛋白在細(xì)胞內(nèi)由彌散分布變?yōu)榫奂植肌?4. PI染色顯示，不同濃度的CuE作用LPS刺激活化的RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞周期大部分阻滯于G2/M期。 5.細(xì)胞因子染色顯示，不同濃度的CuE作用LPS活化的RAW264.7細(xì)胞6小時(shí)后，細(xì)胞因子TNF-α、IL-1的表達(dá)量呈劑量依賴性抑制。 6.核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度的CuE培養(yǎng)LPS活化的RAW264.7細(xì)胞4小時(shí)后，NF-B蛋白核轉(zhuǎn)位的量減少，并呈劑量依賴性。 7.免疫印跡顯示，不同濃度的CuE對(duì)LPS活化的RAW264.7細(xì)胞的MAPKs信號(hào)通路和NF-B信號(hào)通路蛋白并無(wú)太大的影響。結(jié)論： 1. CuE能夠劑量依賴性的抑制RAW264.7細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞形態(tài)，使actin聚集，并使其細(xì)胞周期阻抑于G2/M期，這些可能是CuE起到抗炎作用的機(jī)制之一。 2. CuE能夠劑量依賴性抑制細(xì)胞因子TNF-α和IL-1的表達(dá)，以及NF-B蛋白的核轉(zhuǎn)位，但對(duì)MAPKs信號(hào)通路和NF-B信號(hào)通路活化沒有顯著的影響，表明CuE可能是通過抑制LPS活化的RAW264.7細(xì)胞的NF-B核轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致細(xì)胞因子TNF-α和IL-1的表達(dá)量減少，從而表現(xiàn)出抗炎效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：葫蘆素E 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 脂多糖（LPS） 細(xì)胞骨架 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

摘要3-5
Abstract5-10
一、前言10-18
1 葫蘆素10
2 葫蘆素 E10-14
2.1 葫蘆素 E 的化學(xué)性質(zhì)10-11
2.2 葫蘆素 E 的抗腫瘤作用11-12
2.3 葫蘆素 E 對(duì)細(xì)胞周期的作用12-13
2.4 葫蘆素 E 對(duì)細(xì)胞骨架的影響13-14
3 MAPKs 信號(hào)通路14-15
4 NF-κB 信號(hào)通路15-16
5 本課題的研究目的和意義16-18
二、實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備18-22
1. 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株18
2. 主要試劑18-19
3. 主要儀器19
4. 主要溶液配方19-22
三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟22-27
1. 細(xì)胞培養(yǎng)22
2. 細(xì)胞增殖測(cè)定22
3. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察22-23
4. PI 染色檢測(cè) CuE 對(duì) RAW264.7 巨噬細(xì)胞周期的影響23
5. 細(xì)胞免疫熒光觀察 CuE 對(duì) RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的影響23-24
6. 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè) CuE 對(duì) RAW 264.7 巨噬細(xì)胞內(nèi) TNF-α的表達(dá)24
7. 核質(zhì)分離蛋白抽提和免疫印跡分析24-26
8. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-36
1. CuE 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響27
2. CuE 對(duì) LPS 活化的小鼠巨噬細(xì)胞 RAW 264.7 細(xì)胞形態(tài)的影響27-28
3. CuE 對(duì) LPS 活化的小鼠巨噬細(xì)胞 RAW 264.7 細(xì)胞骨架的影響28-30
4. CuE 對(duì) LPS 活化的小鼠巨噬細(xì)胞 RAW 264.7 細(xì)胞周期的影響30-32
5. CuE 對(duì) LPS 活化的 RAW 264.7 細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子 TNF-α和 IL-1 的影響32-33
6. CuE 對(duì) LPS 活化的 RAW 264.7 細(xì)胞 MAPKs 信號(hào)通路和 NF-κB 信號(hào)通路的影響33-34
7. CuE 對(duì) LPS 活化的 RAW264.7 細(xì)胞 NF-κB 蛋白核轉(zhuǎn)位的影響34-36
五、討論36-39
參考文獻(xiàn)39-47
全文總結(jié)47-48
發(fā)表論文48-49
致謝49