【摘要】：目的： 1.建立大鼠海水浸泡脊髓開放性損傷的動物模型，觀察海水浸泡對脊髓開放性損傷大鼠早期神經(jīng)功能及脊髓病理改變的影響，以評價模型的可靠性。 2.通過觀察大鼠運動功能及運動誘發(fā)電位（MEP）的長期變化以及脊髓血流在一段時間內(nèi)的改變，研究海水浸泡對脊髓開放性損傷大鼠脊髓功能的長期影響和對脊髓局部血流變化的作用，探討早期應(yīng)用Lipo PGE1靜脈注射治療對神經(jīng)功能及脊髓血流的保護和改善作用。 3.通過對傷段脊髓標本神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達情況的測定，研究海水浸泡對脊髓損傷后神經(jīng)細胞凋亡的影響及其機制，探討早期應(yīng)用Lipo PGE1靜脈注射治療的抗凋亡作用。 方法： 1.第一部分實驗成年健康雄性SD大鼠隨機分為A組(假手術(shù)組)、B組（脊髓開放性損傷組）、C組（脊髓開放性損傷+生理鹽水浸泡30min組）、D組（脊髓開放性損傷+生理鹽水浸泡60min組）、E組（脊髓開放性損傷+海水浸泡30min組）和F組（脊髓開放性損傷+海水浸泡60min組）共六組。采用改良Allen’s重物墜落打擊的方法造成大鼠SCI，各組分別于實驗前及干預(yù)后3h、6h、12h、24h、72h六個時間點進行神經(jīng)功能（BBB運動功能評分、Rivlin斜板試驗）檢測，并取傷段脊髓標本大體及HE染色顯微鏡下觀察組織形態(tài)及病理學(xué)變化。 2.第二部分實驗SD大鼠隨機分為Sham組、SCI組、海水浸泡（SW）組及LipoPGE1組共四組。各組分別于術(shù)前、24h、72h、1w、2w、4w、8w七個時間點采用BBB評分、Rivlin斜板試驗比較各組行為學(xué)之間差異；于損傷前、浸泡后0h、24h、72h、1w、2w、4w、8w進行MEP檢測，觀察潛伏期和波幅變化情況；于損傷前、損傷后0h、浸泡后0h、1h、2h、3h、6h、12h、24h、72h利用激光散斑襯比成像（LASCI）系統(tǒng)觀察脊髓背側(cè)血管血流變化情況。 3.第三部分實驗SD大鼠依舊隨機分為Sham組、SCI組、SW組及Lipo PGE1組共四組。分別于干預(yù)后3h、6h、12h、24h、72h、1w六個時間點用TUNEL法檢測脊髓神經(jīng)細胞凋亡情況，免疫組化SABC法檢測Bc1-2、Bax蛋白的表達。 結(jié)果： 1. SCI后各組大鼠BBB評分和Rivlin斜板試驗功能角度值均顯著下降，在72h之前各時間點E、F組與B、C、D組相比并未見明顯差異，然而，在72h時間點，E、F組已明顯低于B、C、D組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，并且F組顯著低于E組，相比之下，B、C、D組在BBB評分和Rivlin斜板試驗功能角度值并未見明顯差異；SCI后各組均出現(xiàn)脊髓水腫、出血、炎癥及壞死等病理損害，單純SCI組的上述病理損害在12h達到高峰，而海水浸泡組在3h、6h時病理損害相對較輕，但在12h、24h及72h時觀察發(fā)現(xiàn)脊髓組織水腫、出血、炎癥及壞死等病理損害迅速加劇，且在程度上已明顯重于單純脊髓損傷組及生理鹽水浸泡組，并且浸泡60min較30min病理改變程度為重，而生理鹽水浸泡組各時間點觀察與單純脊髓損傷組無明顯差異。 2. SCI后各組大鼠BBB評分和Rivlin斜板試驗功能角度值均顯著下降，其后均有所恢復(fù)，但觀察至8w與術(shù)前相比仍顯著低下，SCI各組大鼠在24h時BBB評分和Rivlin斜板試驗功能角度值未見顯著差異，而72h~8w的各時間點SW組均顯著低于SCI組，Lipo PGE1組均顯著高于SW組及SCI組；SCI后MEP信號均消失，24h時可以再次記錄到MEP信號，主要表現(xiàn)為潛伏期的延長，波幅的下降，其后各組均有所恢復(fù)，各組觀察至8w其潛伏期和波幅均未能恢復(fù)至傷前水平，SCI各組大鼠在24h時潛伏期及波幅無明顯差異，72h~8w的各時間點SW組與SCI組相比潛伏期均顯著延長、波幅顯著下降，而Lipo PGE1組潛伏期均較SW組及SCI組顯著縮短，而波幅均顯著增加；各組大鼠SCI后即刻血流速度均顯著下降，且各組間無明顯差異，然后，SW組和Lipo PGE1組按實驗要求進行海水浸泡及給藥，兩組血流速度在浸泡結(jié)束后進一步下降，兩組間血流速度無明顯差異，而此時SCI組血流速度則略有恢復(fù)，且已明顯高于上述兩組，1h、2h時各組血流速度均有所恢復(fù)，1h時三組間血流速度間均具有顯著差異，SCI組＞Lipo PGE1組＞SW組，，至2h時Lipo PGE1組的血流速度僅略低于SCI組，兩者已無明顯差異，但SW組改善緩慢，已顯著低于上述兩組，然而3h時各組血流速度再次下降，6h時SCI組及SW組血流速度繼續(xù)小幅下降，而LipoPGE1組則明顯改善，且已明顯高于SCI組，三組間已有顯著差異， Lipo PGE1組＞SCI組＞SW組，此后三組血流速度均繼續(xù)恢復(fù)，觀察至72h各組均未能恢復(fù)至損傷前水平。 3.各組大鼠脊髓在SCI后3h開始凋亡細胞均顯著增加，并呈現(xiàn)上升趨勢，各組凋亡指數(shù)（AI）均在24h達到最高，隨后開始下降，至1w仍可檢出較多的凋亡細胞（SW組＞SCI組＞Lipo PGE1組），在3h、6h時SW組和Lipo PGE1組AI無明顯差異，并且均顯著低于SCI組，而在其后的各時間點SW組則顯著高于Lipo PGE1組和SCI組，且Lipo PGE1組顯著低于SCI組；SCI后各組3h開始Bcl-2、Bax表達均顯著增加，并呈現(xiàn)上升趨勢，各組Bcl-2表達均在24h達到最高，而Bax表達均在12h達到高峰，隨后均開始下降，至1w均仍有較高表達，SW組Bcl-2表達在各時間點均顯著低于SCI組，而Bax的表達則比較特殊，在3h和6h時顯著低于SCI組，而在其后的各時間點均顯著高于SCI組；Lipo PGE1組在各時間點Bcl-2表達均顯著高于SW組和SCI組，而Bax表達則均低于上述兩組。 結(jié)論： 1.海水浸泡脊髓開放性損傷大鼠模型穩(wěn)定、可靠；海水浸泡可以使脊髓開放性損傷大鼠的神經(jīng)功能惡化，并且浸泡時間越長影響越大；海水浸泡早期可以推遲并減輕損傷段脊髓水腫、出血、炎癥及壞死等病理損害表現(xiàn)，但最終作用是使上述病理損害重于單純損傷段脊髓。 2.無論是行為學(xué)觀察還是神經(jīng)電生理檢測均證實海水浸泡可以對脊髓開放性損傷后的神經(jīng)功能造成長期的影響，不利于其恢復(fù)；SCI后脊髓血流速度會顯著降低，海水浸泡可以使損傷后的血流速度進一步減慢并延長其恢復(fù)時間；早期應(yīng)用LipoPGE1靜脈注射治療可以改善海水浸泡脊髓開放性損傷后的神經(jīng)功能及血流速度，并促進它們的恢復(fù)。 3.海水浸泡可以使脊髓開放性損傷后神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達上調(diào)，但是與單純損傷大鼠相比，Bcl-2的表達較少，而Bax表達卻明顯較多，從而促進了神經(jīng)細胞的凋亡；早期應(yīng)用Lipo PGE1靜脈注射治療可以上調(diào)Bcl-2的表達、下調(diào)Bax的表達，從而起到抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。
【圖文】：

全部結(jié)束后沖洗創(chuàng)面，用 4-0 絲線逐層縫合切口并消毒處理皮膚。開始記錄每只大鼠SCI 造模成功后的時間。（脊髓損傷模型制作過程見圖 1-1。）圖1-1 脊髓損傷模型制作過程

共消耗4%的多聚甲醛約200ml，耗時約1小時。沿原手術(shù)切口剪開背部皮膚直至椎體，仔細游離并完整取出傷段及頭尾段共1.0cm的脊髓組織，放入預(yù)盛有4％多聚甲醛的標本盒中固定24小時。（大鼠灌注取材過程見圖1-2。）圖1-2 大鼠的灌注及脊髓標本的取材2、標本包埋及切片制作（1）沖洗：將固定好的標本修剪好后自來水沖洗24h；（2）梯度脫水： 70%酒精24h→80%酒精24h→95%酒精12h→無水酒精Ⅰ2h→無水酒精Ⅱ2h；（3）組織透明：組織脫水后投入二甲苯：無水酒精（1:1）混合液30min→二甲苯Ⅰ15min→二甲苯 Ⅱ1 0min；（4）浸蠟：石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及包埋蠟放入烘箱中熔化備用，于50℃烘箱中進行
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.2;R-332

【參考文獻】

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本文編號：2706473