【摘要】： 轉(zhuǎn)錄因子及其它許多在細胞增殖、分化等方面發(fā)揮重要作用的蛋白如組蛋 白、DNA和RNA聚合酶、RNA加工蛋白等均在細胞核內(nèi)發(fā)揮作用、大多數(shù) 核內(nèi)蛋白需要內(nèi)源性的核定位信號（nuclear localization signal，NLS）幫助其穿 越核孔復合物而進入細胞核。這個過程包括轉(zhuǎn)運蛋白（又稱NLS-結(jié)合蛋白） 識別和結(jié)合帶有NLS的蛋白，并攜帶其�？坑诤四ど�，然后以耗能的主動運 轉(zhuǎn)方式使之進入細胞核。盡管核蛋白的胞漿——胞核轉(zhuǎn)運機制目前尚未完全 清楚，但是這個轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在進化過程中非常保守。從酵母到哺乳類，核孔復 合物的結(jié)構(gòu)非常相似，轉(zhuǎn)運蛋白也具有很高的同源性。因此，哺乳類蛋白的 NLS在酵母細胞中同樣可以發(fā)揮作用。據(jù)此，我們利用酵母構(gòu)建了從cDNA 文庫中捕獲核定位蛋白基因片段的遺傳篩選系統(tǒng)——核定位信號篩選系統(tǒng)。 該系統(tǒng)包括兩個部分：一是酵母穿梭載體，可表達不含NLS的人工轉(zhuǎn)錄因子， 并含有一個出核信號（nuclear export signal、NES）以保證在沒有NLS存在時 人工轉(zhuǎn)錄因子定位于胞漿而不能進入細胞核激活轉(zhuǎn)錄。二是酵母宿主，其基 因組中含有由人工轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的報告基因。將cDNA文庫插入人工轉(zhuǎn)錄因 子下游的多克隆位點后轉(zhuǎn)化酵母宿主。如果與人工轉(zhuǎn)錄因子融合表達的cDNA 第四軍區(qū)大學俗士學位論文 編碼一 NLS，人工轉(zhuǎn)錄因子就可進入細胞核而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為 酵母可在選擇性培養(yǎng)基上生長，反之則不能。因此利用這個方法理論上可以 從 CDNA文庫中篩選到所有的核定位蛋白基困。 本研究的主要內(nèi)容包括： 1，設(shè)計并構(gòu)建了核定位信號篩選系統(tǒng)，利用已知的編碼＊u和不編碼＊u 的基因片段進行了驗證，證實了該系統(tǒng)能夠有效地甄別表達的融合蛋白中 NLS的有無。驗證了NLS在蛋白質(zhì)中的位置不會影響篩選的效果． 2，將小鼠胚胎的cDNA文庫插入篩選栽體的多克隆位點，轉(zhuǎn)化酵母宿主，，其 中約 l～2O的克隆可在選擇性平板上生長。DNA序列分析表明 600’J上的 克隆的插入片段可編碼典型或不典型的NLS并與載體中的人工轉(zhuǎn)錄因子正 確融合。用EGFP融合的方法驗證它們在哺乳動物細胞中的定位，證實了 這一系統(tǒng)能夠有效地從 CDNA文庫中篩選出核定位蛋白基因片段。因此這 一系統(tǒng)可作為大規(guī)模篩選核定位蛋白基困的一種有效途徑。從文庫篩選出 來的基因中，選取了兩個基因，分別代表已知和未知、有典型NLS和無典 型NLS．對它們進行了初步的功能研究． 3，Txrebl07肛pL6 的研究：利用核定位信號篩選系統(tǒng)確定核糖體蛋白 L6（山osomal Protein L6，RPL6）的 NLS的位置，并在體外培養(yǎng)的細胞中加以 證實。氨基端的3041和68－84 AL酸殘基具有核定位及核仁定位功能。 隨看表達量的提高，RpLO逐漸從核仁定位而成為全細胞核定位。Normem 雜交和RTPCR的結(jié)果顯示，在胚胎期和未分化的細胞中Taxreb107呵L6 的表達量明顯高于成熟組織和已分化的細胞。RpL6又稱Taxr eb 07廠 resPonslvedeme血bindee erotei…，是HTLVI原癌蛋白Tx應(yīng)答序夕J結(jié)合 蛋白．通過篩選噬菌體文庫克隆了 Taxrb 07伽L6的基困組基困，并對外 顯子吶含子的結(jié)構(gòu)進行了分析．Taxrebl07／RpL6的啟動子含有多種包括 NF－KB在內(nèi)的特殊轉(zhuǎn)錄因子的識別位點。我們發(fā)現(xiàn)，Taxrb 07帥L6的啟 動子具有持續(xù)激活的特點。Tx對 Taxreb 07／RpL6的表達和啟動子的活性 一 下四軍醫(yī)大掌協(xié)士學位論文 具有上調(diào)的作用，這種作用是通過啟動子上的NFch識別位點實現(xiàn)的。由 于 HTLVIS’LTR中的 Txrebl07帥L6識別序歹］對 Tx的反式激活有促進 作用，而我們又發(fā)現(xiàn)Taxr N07wL6能夠與Tx直接進行相互作用，所O， Tx通過NF－oh上調(diào) Taxrb107瓜pL6的表達，＆ Taxrbl07服pL6可能 作用于5’LTR及細胞蛋白質(zhì)的合成，n ＆促進T HTLV病毒感染細胞的 增生和病毒基因組的復制。此外，Taxlebl 07徹L6的表達還受到INF和EPO 的調(diào)控�？傊�，Taxrebl07伽L6可能通過多種途徑參與了細胞的增生、分 化及轉(zhuǎn)化等多種生理和病理活動。 4，新的核蛋白 J207的研究：我們篩選到一個功能未知的，J、鼠的 CDNA，全長 共1802七，開放讀框有1464七，編碼488個氨基酸。PSORT軟件分析 表明，J207沒有典型的核定位信號，但它具有七次跨膜樣的結(jié)構(gòu)域和分泌 性信號肽樣的結(jié)構(gòu)域。利用核定位信號篩選系統(tǒng)及體外培養(yǎng)的細胞都證實 全長的J207確實定位于細胞核中。按照軟件分析的結(jié)果將全長片段分為。細 胞外段” 和“細胞內(nèi)及段跨膜區(qū)”，分別轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)“細胞外段”定 位在細胞核中而“細胞內(nèi)及段跨膜區(qū)”定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。用BLAST軟件 在仇陽盯出中沒有發(fā)現(xiàn)與之同源的核菩酸序列，但人類基因組（Geallnd 的登錄號為 ill25408）中包含這段序PI］。分析表明N的 J207可能具有兩 個啟動子和兩種不同的拼接方式，并且廣泛表達于各種組織
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：Q785

【共引文獻】

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本文編號：2692162