【摘要】： 腦挫傷(cerebral contusion)常常引起神經(jīng)細胞大量死亡和嚴重的神經(jīng)功能障礙。一般說來,中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺乏再生能力。研究認為治療腦挫傷的關鍵是:移植外源性細胞來補充或替代損失的神經(jīng)細胞;促進殘存的神經(jīng)細胞存活及軸突生長;重建功能性突觸。神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)可以在受體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)補充或替代損失的細胞;參與神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建;改善損傷局部的微環(huán)境;促進神經(jīng)再生。因此,NSCs移植治療腦挫傷具有良好的應用前景。在本研究中,我們探討體外分離大鼠胚胎前腦NSCs的方法,原代和傳代培養(yǎng)方法和NSCs的鑒定;觀察NSCs培養(yǎng)特性、分化機理及誘導條件,進一步探討將NSCs植入大鼠腦挫傷灶周邊區(qū)成活、遷移和分化情況。 1.大鼠胚胎前腦神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)分化的研究 實驗于2008年11月至2009年10月在河北北方學院實驗中心完成。清潔級,E 16d的Wistar孕鼠(由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供)在無菌條件下取其胚胎,分離出前腦,制備單細胞懸液,以1×106·ml-1和1×108·ml-1分別接種于含N2的DMEM/F12培養(yǎng)瓶中,加入終濃度為20ng·ml-1表皮細胞生長因子(epidermal growth factor, EGF)和10ng·ml-1堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)刺激其克隆生長。誘導分化實驗分為懸浮培養(yǎng)實驗和爬片培養(yǎng)實驗。a懸浮培養(yǎng)實驗分為三組:體積分數(shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) +20ng·ml-1 EGF +10ng·ml-1 bFGF,10%FBS,20%FBS,在上述誘導條件下刺激其分化。b爬片培養(yǎng)實驗分為三組:多聚賴氨酸鋪板組、明膠鋪板組和無鋪板組,采用體積分數(shù)為20% FBS刺激分化。研究采用免疫細胞化學和間接免疫細胞熒光染色法檢測NSCs巢蛋白(nestin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)和微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2, MAP-2)。結(jié)果成功從胎鼠前腦分離出神經(jīng)干細胞,巢蛋白表達陽性。a懸浮培養(yǎng)實驗在不同誘導條件下,20%FBS組促分化作用略強于10% FBS組(P0.05)。10% FBS組促分化作用強于10%FBS +20ng·ml-1 EGF +10ng·ml-1 bFGF組(P0.05)。NSCs分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞。b爬片培養(yǎng)實驗中,多聚賴氨酸鋪板組和明膠鋪板組貼壁后分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的能力強于無鋪板組(P0.01)。多聚賴氨酸鋪板組略強于明膠鋪板組(P0.05)。神經(jīng)譜系標記物中的GFAP,NSE和MAP-2免疫細胞化學及間接免疫細胞熒光染色均陽性。結(jié)論:大鼠胚胎前腦NSCs可以通過體外培養(yǎng)獲得,且具有增殖能力和多向分化潛能。20%血清組NSCs分化顯著,10%FBS+EGF +bFGF組NSCs分化不顯著。多聚賴氨酸和明膠作為細胞貼壁支持物可以提高分化細胞數(shù)量,而且多為星形膠質(zhì)細胞。 2.神經(jīng)干細胞在大鼠腦挫傷灶周邊區(qū)成活和遷移 本研究利用體外無血清培養(yǎng)技術,加EGF和bFGF刺激大鼠胚胎源性前腦NSCs克隆增殖。傳1代后,NSCs在培養(yǎng)過程中加入終濃度為6μg·ml-1 5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine, BrdU)。標記BrdU的NSCs,用免疫細胞化學和間接免疫細胞熒光染色檢測其增殖能力。研究采用改進的Fenney’s自由落體腦挫傷模型,于致傷1d后,將NSCs用立體定位法移植到鼠腦挫傷灶邊緣皮層內(nèi),免疫組化及免疫熒光雙染法觀察移植后1,7,14,21d NSCs在挫傷灶周邊成活,遷移和分化情況。結(jié)果,移植后1,7,14,21d,損傷灶BrdU陽性細胞數(shù)目逐漸減少;BrdU陽性細胞在損傷灶周邊散在分布,并向損傷皮層下遷移。損傷后灶區(qū)GFAP表達上調(diào),并在時間上具有一定規(guī)律性。結(jié)論:本研究結(jié)果顯示,大鼠胚胎前腦獲得的NSCs在異體移植后,能夠在受體大鼠腦損傷灶周邊區(qū)存活和遷移;形態(tài)學上,其顯示出與腦組織整合的特點。
【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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本文編號：2691893