【摘要】：丙型肝炎病毒(HCV)是導(dǎo)致輸血后肝炎和非甲非乙型肝炎的主要病原，全世界有1.7億HCV感染者，約50％～90％的感染者轉(zhuǎn)變?yōu)槁猿掷m(xù)性感染。HCV抗原表位的研究，將有助于解決對(duì)這一高度變異的病毒的致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)及預(yù)防、治療方面遇到的難題。本文對(duì)HCV一些保守的B淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原表位的基因合成、克隆、表達(dá)及免疫學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。 HCV C蛋白的結(jié)構(gòu)保守，其N端具有明顯的親水性，含有多個(gè)保守的抗原表位。我們選擇其中2個(gè)保守的抗原表位C1、C2(C_(2～21)，C_(33～46))進(jìn)行化學(xué)合成，合成的基因片段以Bsu 36I位點(diǎn)構(gòu)建到昆蟲病毒Flock house virus(FHV)的結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因RNA2的L1(aa205)位點(diǎn)上。我們之所以選用FHV-RNA2編碼的昆蟲病毒外殼蛋白作為嵌合表達(dá)抗原表位的載體蛋白，是因?yàn)槠浔砻嬗卸鄠�(gè)親水區(qū)域，可供小片段外源抗原表位插入。這些可供插入的位置分別是FHV-RNA2上的3個(gè)環(huán)(Loop，簡稱L)和3個(gè)插入位點(diǎn)(Insert，簡稱I)，它們都突出于FHV-RNA2編碼的外殼蛋白分子表面，這種特殊的結(jié)構(gòu)增加了外源抗原表位獲得接近其天然構(gòu)象的機(jī)會(huì)，并將外源抗原呈遞于外殼蛋白的表面，使其具有很高的親水性，有利于提高表達(dá)產(chǎn)物的抗原性及免疫原性。重組質(zhì)粒pET-RNA-C1、pET-RNA-C2在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了穩(wěn)定高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的35％左右。Western Blot結(jié)果表明，該蛋白可被抗-HCV陽性病人血清特異識(shí)別。利用Q-FF／HP陰離子交換層析和SDS-PAGE凝膠電泳純化分離重組蛋白。純化的重組抗原免疫豚鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生了高滴度的抗HCV C蛋白表位的抗體；Western Blot和ELISA檢測結(jié)果顯示：重組抗原RNA-C1、RNA-C2具有良好的抗原性及免疫原性；并且證明了FHV RNA2抗原表位呈遞系統(tǒng)可使外源HCV C1、HCV C2表位的抗原性及免疫性有不同程度的改善(p＜0.05)。
【圖文】：

陽性克隆用SpeFNeol雙酶切后，應(yīng)分別產(chǎn)生4sgbp和468bp大小的片段，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET~RNA一Cl、pET-RNA一CZ構(gòu)建正確。見圖1.3。EPT一RNA一cl、EPT一RNA一2c測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中所插入的Cl、CZ抗原表位基因與預(yù)先設(shè)計(jì)完全相符。見圖1.4、1.5。2.重組pET-RNA一cl抗原表位基因在大腸桿菌中的表達(dá)pET一RNA一cl、pET一RNA一cZ抗原表位基因在大腸桿菌BLZI中的表達(dá)產(chǎn)物分子量分別與預(yù)期值(46.2Dk‘和45.5KD)相符，，表達(dá)蛋白量占菌體總蛋白的35%左右。見圖1.6。bp123今558T、540‘、、504~es‘上二二458尸曰勺曰戶.戶~~.es267、~~味一-一234eees竺二竺213曰代Zee一192/產(chǎn)圖1.3重組質(zhì)粒，__、:‘牛夢‘，-3稱srticti叩naa，ys‘5ofrecombnian‘p，as而dspE示。A一eland面一ha一eZ石并渴成罵瀑默霉篤欲{矛i磊群A一C“‘ge’‘e‘“‘htSpe““c。“‘89bp，;

RNA一CZ構(gòu)建正確。見圖1.3。EPT一RNA一cl、EPT一RNA一2c測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中所插入的Cl、CZ抗原表位基因與預(yù)先設(shè)計(jì)完全相符。見圖1.4、1.5。2.重組pET-RNA一cl抗原表位基因在大腸桿菌中的表達(dá)pET一RNA一cl、pET一RNA一cZ抗原表位基因在大腸桿菌BLZI中的表達(dá)產(chǎn)物分子量分別與預(yù)期值(46.2Dk‘和45.5KD)相符，表達(dá)蛋白量占菌體總蛋白的35%左右。見圖1.6。bp123今558T、540‘、、504~es‘上二二458尸曰勺曰戶.戶~~.es267、~~味一-一234eees竺二竺213曰代Zee一192/產(chǎn)圖1.3重組質(zhì)粒，__、:‘牛夢‘，-3稱srticti叩naa，ys‘5ofrecombnian‘p，as而dspE示。A一eland面一ha一eZ石并渴成罵瀑默霉篤欲{矛i磊群A一C“‘ge’‘e‘“‘htSpe““c。“‘89bp，;，二3.重組pET~RNA一C抗原的純化制備3.1超聲裂解細(xì)菌細(xì)胞第19頁
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2685139