【摘要】：精子形成過程一般分為三個不同的階段，1)精原細(xì)胞通過有絲分裂快速擴增；2)精母細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成精細(xì)胞，在這一過程中伴有同源染色體的配對和交換；3)精細(xì)胞變形成為精子。在這三個過程中，有許多睪丸特異和非特異基因次第表達(dá)，并在生精過程中發(fā)揮著重要作用。 四川大學(xué)華西醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳室近年來致力于男性不育相關(guān)基因的克隆及功能研究工作，并取得了一些進(jìn)展。通過消減雜交，mRNA差異顯示等技術(shù)，克隆了多個可能與男性生育相關(guān)的新基因，如ZNF230、ZNF463、ZNF313及TCP11等。這些基因基本上在睪丸組織中均有高表達(dá)或特異表達(dá)。目前該實驗室正運用酵母雙雜交、基因敲除、RNAi等多種方法研究這些基因的功能。 為了在蛋白質(zhì)水平研究這些基因在睪丸組織的表達(dá)情況，我們將TCP11基因和ZNF313基因克隆到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并利用表達(dá)的蛋白制備抗體，進(jìn)行組織化學(xué)分析，以期了解這些基因在睪丸組織中的表達(dá)狀態(tài)，對其功能進(jìn)行進(jìn)行推測。 第一部分：人受精促進(jìn)肽受體TCP11a基因的蛋白表達(dá)及細(xì)胞組織分布 人TCP11基因編碼人受精促進(jìn)肽受體，該基因存在多個剪切體。我們選擇剪切體TCP11a基因進(jìn)行表達(dá)，制備抗體以研究TCP11蛋白在睪丸及精細(xì)胞上的分布。 通過PCR等分子克隆技術(shù)，我們將TCPlla基因克隆到pBv220表達(dá)載 體上，通過DNA測序及表達(dá)產(chǎn)物的N一端測定證實了克隆基因表達(dá)產(chǎn)物的正確 性。然后我們還對工程菌TCPlla蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了研究，使TCPlla蛋 白在工程菌中高效表達(dá)。并利用表達(dá)蛋白制備的抗體進(jìn)行了組織化學(xué)分析。 結(jié)果顯示:TCPll蛋白在鼠皋丸組織中分布具有細(xì)胞特異性，即它僅見于長 形精子細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞膜上，而在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、支持細(xì)胞、 間質(zhì)細(xì)胞和精子的細(xì)胞核中均未觀察到。這提示TCPll基因可能在精子的最 后成熟時期才發(fā)揮作用，并對精子形態(tài)及其生理功能有重要作用。對可育男 性成熟精子的熒光標(biāo)記結(jié)果顯示，TCPn蛋白主要分布于精子的頂體和尾部， 該結(jié)果與鼠TCPn蛋白在其精子表面分布結(jié)果基本一致。 在上述工作基礎(chǔ)上，運用生物信息分析方法，對TCPll基因及TCPlla 蛋白進(jìn)行了深入分析。將人TCPll基因與小鼠、大鼠、雞及猩猩的同源基因 進(jìn)行了同源性分析，包括比較各外顯子和內(nèi)含子的保守性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TCPn 基因上游約3Okb的范圍內(nèi)有許多保守的非編碼序列，它們很可能是調(diào)控 TCPn基因特異性表達(dá)的增強子或其他調(diào)控元件。對其中最保守的一個非編 碼序列進(jìn)行共有調(diào)控因子結(jié)合位點預(yù)測的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該序列內(nèi)存在較多的重 要調(diào)控因子的結(jié)合位點。對人TCPll基因的CPG島分析發(fā)現(xiàn)在人TCPH啟動 子區(qū)周圍存在的一個CpG島，同樣存在于大鼠、小鼠。啟動子區(qū)CpG島的甲 基化和去甲基化可能參與了TCPn的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。對TCPlla蛋白的二級結(jié)構(gòu) 預(yù)測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白結(jié)構(gòu)十分特殊，二級結(jié)構(gòu)中僅有Q一螺旋結(jié)構(gòu)。它 有較多的潛在的翻譯后修飾位點，特別是不同類型的磷酸化位點。對TCPll 基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析有助于了解它們的功能。 第二部分:人精子發(fā)生相關(guān)基因--一多W召了3在大腸桿菌中的克隆表達(dá)及組 織分布 鋅指蛋白是一類廣泛存在于動植物及人類的DNA結(jié)合蛋白。由于能選 擇性地結(jié)合各種DNA和RNA序列，它們在基因的表達(dá)調(diào)控中起著十分重要的 作用。CZHZ和C3HC4鋅指是較為常見的兩種鋅指結(jié)構(gòu)域，但很少同時存在于 同一個鋅指蛋白。而我們克隆表達(dá)的ZNF313蛋白卻同時含有這兩種結(jié)構(gòu)域。 利用PCR方法，將人ZNF313基因克隆到pET一32(a)載體上，使之以融 合蛋白形式表達(dá)。在DNA序列測定、蛋白N一端序列測定證實了克隆表達(dá)的正 確性后，我們對工程菌發(fā)酵條件、蛋白純化條件進(jìn)行了研究，并利用純化的 ZNF3 13蛋白制備抗體供人辜丸組織切片組織化學(xué)分析。免疫組化分析顯示在 精原細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞、精母細(xì)胞的細(xì)胞核中出現(xiàn)，而Sertoli細(xì)胞、精 子細(xì)胞中未.呈陽性反應(yīng)。這表明ZNF313基因在翠丸特定細(xì)胞類型的特定階 段中進(jìn)行表達(dá)，并提示它在生精過程中可能發(fā)揮重要作用。 對ZNF313蛋白和基因的生物信息學(xué)分析獲得了如下的結(jié)果:1)ZNF313 鋅指結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)模擬發(fā)現(xiàn)ZNF3 13的Ring鋅指和第二個CZHZ鋅指均可 以形成正常的鋅指結(jié)構(gòu);2)通過EST序列拼接電子克隆法獲得了稱猴、大 鼠、非洲蛙、非洲爪蟾、青鱷、虹蹲及豬的ZNF313直系同源基因，通過基 因組比對，，獲得了雞的ZNF313同源基因。蛋白質(zhì)水平的比對發(fā)現(xiàn):不同種 生物ZNF313的RING和三個CZHZ鋅指結(jié)構(gòu)其周圍的氨基酸序列均十分保守， 提示幾個鋅指結(jié)構(gòu)域?qū)τ赯NF3 13的生物學(xué)功能可能具有十分重要的作用。3) 對人和黑猩猩ZNF313基因上游調(diào)控因子的結(jié)合位點分析表明:轉(zhuǎn)錄起始位 點上游30一13Obp處有一個十分保守的區(qū)域，后者包涵有有許多重要轉(zhuǎn)錄調(diào) 控因子的潛在結(jié)合位點。它們可能是與調(diào)控因子相互作用的靶點。然而人 ZNF313與小鼠Znf313的上游調(diào)控因子結(jié)合位點比較則發(fā)現(xiàn)它們的同源保守 性較低，這是否意味著人與小鼠ZNF3 13的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式不同，尚待研 究。4)旁系同源基因分析結(jié)構(gòu)表明，在人16q24.3區(qū)域存在的一個基因， 其蛋白結(jié)構(gòu)與ZNF313非常相近
【圖文】：

6、PurifiedreeombinantTCPllaProteinFigg:ExPressionandPurifieationofTCPllaProteininE.ColiDH5a圖9:TCPlla蛋白在E.ColiDHS。表達(dá)及純化各步電泳結(jié)果22

Fig.12TheseeondstrueturePredieationofTCPlla圖12.TCPlla蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測2.5‘2TCPlla蛋白的修飾位點的預(yù)測分析分析結(jié)果表明TCPll蛋白具有較多的潛在的蛋白修飾位點，如N一糖基化位點，豆范酞化位點，和磷酸化位點等等。值得注意的是，這個蛋白磷酸25
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：Q786

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本文編號：2680133