發(fā)布時(shí)間：2020-05-23 18:43

【摘要】：白細(xì)胞介素(2（IL(2）最初曾被稱為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，并能促使各種造血細(xì)胞增殖和分化。臨床研究表明其關(guān)鍵作用可作為T淋巴細(xì)胞激活的增殖信號(hào)，因而將IL(2用于治療艾滋病�；谄淠艽碳ぞ哂屑�(xì)胞毒的，抗腫瘤細(xì)胞的能力，IL(2還用于各種癌癥的治療。目前人IL(2已經(jīng)完全用基因工程的方法生產(chǎn)，而且基因工程IL(2與天然IL(2的功能和臨床效果基本一致。 目的：近年來(lái)，雖然基因工程IL(2應(yīng)用于肝炎及某些癌癥的治療已取得令人矚目的成果，但大劑量，長(zhǎng)時(shí)間用藥對(duì)病人仍然存在一定的毒副作用，如發(fā)熱，寒戰(zhàn)，惡心，嘔吐，頭暈，乏力和毛細(xì)血管滲漏綜合癥等，所以，為了提高人重組白細(xì)胞介素-2的穩(wěn)定性和活性以及減少毒副作用，有必要定向改造rhIL-2的分子結(jié)構(gòu)。本研究在畢赤酵母中高效表達(dá)hIL-2cDNA，獲得hIL-2蛋白，擬對(duì)天然型hIL-2進(jìn)行改構(gòu)以獲得新的突變體，同時(shí)進(jìn)行活性測(cè)定，以便深入了解hIL-2的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。方法：用PCR法從白細(xì)胞介素-2（IL-2）cDNA全序列中擴(kuò)增成熟的肽基因片段，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)將人重組白細(xì)胞介素-2第125位游離的半胱氨酸編碼序列突變?yōu)楸彼嵝蛄�；編碼18 位亮氨酸的序列突變?yōu)榈鞍彼嵝蛄校痪幋a19位亮氨酸的序列突變?yōu)榻z氨酸序列，經(jīng)限制酶酶切片段分析與DNA序列分析證明后，獲得三突變體MvhIL-2。IL(2基因片段與酵母中間載體pPIC9K融合后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F'，擴(kuò)增質(zhì)粒，獲取大量pPIC9K-MvhIL-2DNA后，再轉(zhuǎn)化畢赤酵母，并在畢赤酵母中表達(dá)突變蛋白(IL(2-C125A/L18M/L19S)。利用IL(2依賴細(xì)胞株CTLL-2細(xì)胞對(duì)純化的突變蛋白(IL-2-C125A/L18M/L19S)和野生型IL(2進(jìn)行測(cè)活。結(jié)果：本研究成功地構(gòu)建IL(2突變體，并在畢赤酵母中得到表達(dá)。作為一種真核生物，畢赤酵母比起其它更高級(jí)的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)有許多優(yōu)點(diǎn)：例如在蛋白加工，蛋白折疊和轉(zhuǎn)錄后修飾等方面，同時(shí)，它又和大腸桿菌或啤酒酵母一樣具有分子水平和基因水平操作容易的優(yōu)點(diǎn)，比其它真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒或哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)更快，更容易，消耗更少，而且表達(dá)水平高，有10倍到100倍表達(dá)異源蛋白的能力。這些特點(diǎn)使畢赤酵母作為蛋白表達(dá)系統(tǒng)非常有用。將pPIC9K-MvhIL-2DNA用SalI酶切后，轉(zhuǎn)入真核表達(dá)系統(tǒng)?畢赤氏酵母得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶發(fā)酵，上清液用15%SDS-PAGE檢測(cè)表明有IL(2突變體的表達(dá)；經(jīng)Western-blot檢測(cè)有免疫活性。經(jīng)超濾濃縮，強(qiáng)陽(yáng)離子交換S柱和分子篩層析得到純化的MvhIL-2。純化的突變蛋白對(duì)CTLL-2細(xì)胞具有刺激性；與野生型IL-2相比，在各種溫度條件下儲(chǔ)存的突變蛋白保留有更高的活性；pPIC9KMvIL-2整合到畢赤酵母中表達(dá)量占菌體總蛋白的30%以上，高表達(dá)得到的 WP=5 IL-2具有高活性。結(jié)論：人IL-2cDNA可通過PCR 技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變，所獲得的突變型MvIL-2 活性比天然型NhIL-2高5倍。所以IL-2 突變體(IL-2-C125A/L18M/L19S)較野生型的IL-2具有更高的穩(wěn)定性和活性
【圖文】：

重慶大學(xué)博士學(xué)位論文產(chǎn)的基本過程重組對(duì)象的目的基因插入載體，，拼胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，�；蚬こ碳夹g(shù)使得很多從自然界 年代以來(lái)，以大腸桿菌作為宿主等，為人類獲取大量醫(yī)用價(jià)值高的程序是，目的基因的克隆，構(gòu)建 程菌，工程菌的發(fā)酵，外源基因表。以上程序中的每個(gè)階段都包括生產(chǎn)的不同而有所改變。

列（TATA 盒）在翻譯起始部位上游 77 bp 處，轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)在距起始-2 基因 TATA 盒上游-319－-52 的區(qū)域有多個(gè)增強(qiáng)子元件：AP-1CAG)與 PMA 和 IL-1 誘導(dǎo) IL-2 產(chǎn)生有關(guān)；NFκB 樣增強(qiáng)子、抗原受合活化 T 細(xì)胞產(chǎn)生核因子(NFAT-1)的元件以及結(jié)合 Qct-1/NF-IL與 IL-2 的基因表達(dá)調(diào)控。 2 前體由 153 個(gè)氨基酸殘基組成，在分泌出細(xì)胞時(shí)，其信號(hào)肽基）被切除，產(chǎn)生了成熟的 IL 2，其相對(duì)分子量為 15420[10]，3 所示。IL 2 翻譯后經(jīng)糖基化和唾液酸化修飾，如在第 3 位的蘇，因此 IL 2 是糖蛋白，相對(duì)分子量約為 (14~17)×103，等電點(diǎn)L 2 的糖基變化很大，主要是蘇氨酸 3 的唾液酸化，糖基化與否功能，但糖基化的差異與 IL 2 不同的分子量和等電點(diǎn)有關(guān)。IL 位是半胱氨酸（Cys）殘基，其中 58 Cys 和 105Cys 之間形成分保持其生物活性是必不可少的。125Cys 的巰基呈游離狀態(tài)，與 多聚體有關(guān)，很不穩(wěn)定，在某些情況下可與 58 位或 105 位的巰鍵，從而使 IL 2 失去活性。expressor
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 虞建良,范佩芳,鄭宏大,孫蘭英,王子軒,鄭仲承,李伯良,陳寅,唐建偉,劉新垣;人白細(xì)胞介素-2在大腸桿菌高效表達(dá)及其純化與鑒定[J];中國(guó)科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1995年10期

2 蔣春雷,徐荻,周月芳,鄭仲承,劉新垣,宋朝佑,路長(zhǎng)林;人白細(xì)胞介素-2結(jié)構(gòu)與鎮(zhèn)痛功能關(guān)系的研究[J];中國(guó)科學(xué)C輯:生命科學(xué);1996年01期

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5 唐建偉,劉愛萍,虞建良,范佩芳,劉新垣;兩種新型白細(xì)胞介素-2的熱穩(wěn)定優(yōu)越性[J];生物工程學(xué)報(bào);1996年04期

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8 彭毅,步威,康良儀;甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)[J];生物技術(shù)通報(bào);2000年01期

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10 張旭，黃秉仁，蔡良婉;白細(xì)胞介素－2的基因克隆及其在啤酒酵母細(xì)胞中的表達(dá)[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);1995年04期

本文編號(hào)：2677791