發(fā)布時間：2020-05-22 19:54

【摘要】：細胞自噬(autophagy)是真核細胞內(nèi)依賴溶酶體的降解和再循環(huán)系統(tǒng),是真核細胞最基本和保守的生理功能之一,在清除細胞內(nèi)錯誤折疊蛋白、衰老細胞器,以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。細胞自噬還是真核細胞應對環(huán)境應激和脅迫刺激的基本反應。細胞自噬異常與腫瘤、代謝綜合征、神經(jīng)退行性病變等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關,對細胞自噬分子調(diào)控機理的研究具有重要的理論和實際意義。細胞自噬的最重要特征是通過在細胞內(nèi)形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡(autophagosomes)包裹待降解底物,與溶酶體融合實現(xiàn)對自噬底物的降解。自噬泡的形成受細胞自噬誘導信號精確而嚴密的調(diào)控,眾多自噬相關蛋白參與其中。Sirtuin 1 (Sirtl)是定位于哺乳動物細胞核內(nèi),活性依賴于其輔酶NAD+的組蛋白脫乙�；�。通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多種信號通路,Sirtl參與細胞的生長、代謝和衰老。近期研究提示,Sirtl的活性在細胞自噬調(diào)控中發(fā)揮重要作用,但細胞自噬時Sirtl激活的分子機制尚不明確。3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是細胞內(nèi)高度保守和表達恒定的“管家蛋白”,通過催化3磷酸甘油醛脫氫,在糖酵解過程發(fā)揮關鍵作用。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)誘導細胞自噬時,伴隨細胞內(nèi)自噬泡的形成,定位于細胞質(zhì)中的GAPDH由細胞質(zhì)移位至細胞核。在不能形成自噬泡的Atg5-/-和AtgT-/-MEF細胞中,GAPDH仍可由自噬信號誘導入核,提示GAPDH入核是自噬發(fā)生中的早期事件。下調(diào)GAPDH蛋白水平或特異性阻斷GAPDH入核能顯著抑制自噬泡的形成；過表達攜帶有核定位序列的GAPDH顯著誘導自噬的發(fā)生,表明核內(nèi)GAPDH是細胞自噬的重要調(diào)節(jié)因子。表達缺失糖酵解活性或不能發(fā)生亞硝基化修飾的GAPDH突變體,并不影響GAPDH入核和細胞自噬水平,提示GAPDH入核及其對細胞自噬的調(diào)控并不依賴其糖酵解活性或亞硝基化修飾。同時,使用AMPK腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)的小分子激活劑和抑制劑,我們證明細胞自噬過程中GAPDH的入核受AMPK活性的調(diào)控。在GAPDH入核調(diào)控細胞自噬的機制研究中,利用免疫共沉淀和GST蛋白沉降等方法,我們發(fā)現(xiàn)細胞自噬時,核內(nèi)GAPDH與Sirt1相互作用。下調(diào)Sirt1蛋白水平或特異性抑制Sirt1活性能顯著抑制核內(nèi)GAPDH誘導的自噬發(fā)生,表明Sirt1活性在細胞自噬中的必要性。進一步的研究表明,細胞自噬時Sirt1的輔酶NAD+濃度沒有升高,GAPDH與Sirt1的結(jié)合造成Sirt1與其抑制蛋白DBC1的解離而活化�；罨腟irt1脫乙�；允上嚓P蛋白LC3等,最終誘導自噬發(fā)生。該研究首次鑒定出糖酵解酶GAPDH是細胞自噬的重要調(diào)控因子,在自噬信號的胞質(zhì)胞核傳遞中發(fā)揮關鍵作用。通過明確GAPDH入核激活Sirt1,我們的研究揭示了一條新的細胞自噬信號途徑。
【圖文】：

抑制有絲分裂后期的核膜紐裝（Ｎａｋａｇａｗａ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００３）；邋ＧＡＰＤＨ與小Ｇ蛋白Ｒａｂ２逡逑結(jié)合，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的膜泡運輸巧ｓｄａｌｅｅｔａｌ．，２００４）；邋ＧＡＰＤＨ還能特異逡逑性地移位到細胞核，發(fā)揮多種重要功能（圖１）。在核內(nèi)，ＧＡＰＤＨ作為Ｏｃｔｌ的共逡逑轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控Ｓ期Ｈ２Ｂ基因的轉(zhuǎn)錄（Ｚｈｅｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００３）；邋ＧＡＰＤＨ可Ｗ調(diào)控ｔＲＮＡ逡逑的核輸出和維持邋ｍＲＮＡ邋巧穩(wěn)定性（Ｎａｇｙ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０００；邋Ｓｉｎｇｈ邋ａｎｄ邋Ｇｒｅｅｎ，邋１９９３）；逡逑ＧＡＰＤＨ還能與端粒特異性的結(jié)合，調(diào)按端粒的生長（Ｓｕｎｄａｒａｒａｊｅｔａｌ．，，邋２００４）。一氧逡逑化氮（Ｎ巧處理時，ＧＡＰＤＨ能發(fā)生亞硝基化修飾，通過與Ｅ３泛素連接酶Ｓｉ化１逡逑結(jié)合，移位至細胞核，激活核內(nèi)的石憸化酶ｐ３００，乙憸化ｐ５３等恥蛋白，誘導細逡逑胞調(diào)亡（Ｈａｒａｅｔａｌ．

＋學位論文邐邐＾邐結(jié)論逡逑所述，本文揭示了一條新的細胞自喧調(diào)控途徑，如圖２所示，自唾信號逡逑巧能量狀態(tài)調(diào)節(jié)蛋白ＡＭＰＫ，促使糖酵解酶ＧＡＰＤＨ由細胞質(zhì)移位至細逡逑合核巧的脫石就化酶Ｓｉｒｔｌ，通過使其活性抑制蛋白ＤＢＣ１解離激活Ｓｉｒｔｌ，逡逑發(fā)生。逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R363


本文編號：2676520