【摘要】： 本實驗是在中國人類基因組南方研究中心2001年10月份完成我國境內(nèi)問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株#56601(Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar lai type strain #56601)(強毒株)全基因組測序的基礎(chǔ)上開展的。在部分參與基因注釋過程中，發(fā)現(xiàn)一系列和致病相關(guān)的基因，如黏附和侵襲相關(guān)基因、鞭毛基因、運動／趨化相關(guān)基因、LPS合成相關(guān)基因、信號傳導基因、與溶血、貧血、黃疸相關(guān)的溶血素基因、與出血相關(guān)基因、調(diào)節(jié)菌體生長狀態(tài)的凋亡基因等等。致病性鉤端螺旋體全基因組所揭示的獨特的生理學和病理學特征發(fā)表在2003年4月24日出版的Nature雜志，其中與溶血、出血、菌體凋亡相關(guān)的部分基因功能的研究結(jié)果來自本實驗。 鉤端螺旋體(Leptospira)是一種呈細長絲狀、圓柱形、螺旋盤繞規(guī)則而致密的螺旋體，它需氧、運動活潑，是一種既能在體內(nèi)生長、又能在體外培養(yǎng)的微生物，在世界范圍引起人獸共患病—鉤端螺旋體病。其體外生長受到很多因素的影響。較適宜的培養(yǎng)基為EMJH和Korthof培養(yǎng)基，但生長緩慢(需40～50個小時達到對數(shù)期)，菌濃低。幼齡豚鼠感染實驗證明：體外培養(yǎng)的有毒株仍然具有強致病性，無毒株無致病力，兩者在毒力方面有顯著差別。 利用生物信息學手段首次預測鉤端螺旋體染色體共編碼了十個溶血素基因，其中九個未知，分為兩大類，即鞘磷脂酶類(LA1027，LA1029，LA3050，LA4004)和非鞘磷脂酶類(LA0327，LA0378，LA1650，LA3937，LA0150)。在原核系統(tǒng)中克隆、表達并純化了其中八個溶血素基因，血平板“熱-冷孵育”法鑒定了這些蛋白的溶血功能。薄層層析法和高效液相色譜法進一步鑒定LA1027，LA1029，LA3050和LA4004的鞘磷脂酶活性。如此眾多的溶血素基因同時編碼于同一個染色體上，這在微生物界是首次發(fā)現(xiàn)。 RT-PCR實驗證明溶血素基因在鉤端螺旋體中都轉(zhuǎn)錄；Western-blot實驗證明在EMJH環(huán)境下，大多數(shù)溶血素基因都表達(LA1027不表達，LA3050只在有毒株中表達)，而且和毒性無關(guān)；ELISA實驗證實多數(shù)溶血素蛋白均能被分泌到菌體外，分泌量和毒力相關(guān)(其中LA1027和LA0378幾乎為零)。 鉤端螺旋體鞘磷脂酶類溶血素LA1029和非鞘磷脂酶類溶血素LA3937均對細胞有顯著的毒性作用，致使細胞絨毛消失，細胞膜破裂或完全消失，胞質(zhì)外漏，胞槳染色變淺，細胞器腫大、外溢、丟失，細胞核出現(xiàn)空泡，細胞染色質(zhì)凝集，甚至核膜邊緣不整齊，有破裂，細胞壞死現(xiàn)象嚴重。大量的細胞碎片黏附在為數(shù)不多的完整細胞表面。部分肝細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡現(xiàn)象，如線粒體腫大，細 沈陽藥科大學博仁學位論文 摘要 胞核邊聚、濃縮、有多個核結(jié)構(gòu)，裂解為核小體。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)LA 1 029 能誘發(fā)14.73%一57.92%的肝細胞發(fā)生凋亡，，但是不能誘發(fā)腎細胞293凋亡; LA3937能引發(fā)腎細胞周期改變。人cDNA array結(jié)果表明LA1029能顯著改變肝 細胞的表達譜，其中90個基因的表達發(fā)生顯著變化，上調(diào)基因10個，下調(diào)基因 80個，這些基因主要分布在與腫瘤發(fā)生、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、細胞周期、代 謝、蛋白質(zhì)合成等方面，說明 LA 1 029能引起組織細胞的多種病理改變。此外， 溶血素LA 1 029能刺激細胞分泌炎癥介導因子IL一lp和IL一6。說明鉤端螺旋體溶 血素即能引起嚴重的細胞壞死，也能引起細胞凋亡，和鉤體病患者的組織器官炎 性反應、發(fā)熱、功能障礙、衰竭有直接關(guān)系。 鉤端螺旋體染色體還編碼一套可能和出血病癥相關(guān)的基因，包括1個溶菌酶 基因(acm)，1個膠原酶基因(colA)，17個Yer6’inia YopM蛋白基因(，勿，卿、 l個血小板激活因子乙酞化酶基因切曠ah)、2個類似于von Willebrand faetorA domain的基因(vwA了，v砂月2)。這些基因除了vwAZ之外均轉(zhuǎn)錄，由此推測構(gòu)建 一副出血模型圖。 以牛腦胞內(nèi)PAF一AHI型蛋白Y亞基1認AB(PDB數(shù)據(jù)庫編號)為模件，計 算機模擬出鉤端螺旋體隊F一AH(LAZ 144)蛋白的立體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它們極其相似， 酶催化位點(ser“’一Hisz08一Asp20，)保守。檢測菌體和培養(yǎng)上清液中隊F一AH酶活 性，發(fā)現(xiàn)其不分泌到細胞外，可能是一種胞內(nèi)酶。Westom一blot顯示隊F一AH表 達量與毒性相關(guān)�？寺�、表達并純化重組蛋白PAF一AH，發(fā)現(xiàn)其米氏常數(shù)Km同 正常人血清Km，血小板凝集實驗進一步證明重組PAF一AH具有阻止血小板聚集 的生物學活性。比較血清隊F一AH酶活性，發(fā)現(xiàn)黃疽出血群患者酶活性顯著高于 正常人和其他型鉤體病患者，推測這可能是由于毒力株黃疽出血群鉤體釋放了大 量PAF一AH到人體血液系統(tǒng)中，滅活宿主體內(nèi)血小板激活因子(PAF)的生理活 性，使血小板不能勤附、聚集到毛細血管微小受損處，不能分泌眾多凝血因子， 從而妨礙宿主的止血及凝血，導致大出血癥狀，是鉤端螺旋體出血癥狀的重要致 病因子之一。 比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)鉤端螺旋體編碼了一對緊密聯(lián)系的基因座vopBc loci， 該基因與其他微生物中的同類基因在氨基酸序列和操縱子結(jié)構(gòu)上相似。在大腸桿 菌表達系統(tǒng)中單獨表達v即刀、vopc基因，發(fā)現(xiàn)vopC基因產(chǎn)物抑制菌體的生長， 同時表達vaPB和vaPc基因時，菌體生長正常。這種現(xiàn)象與現(xiàn)
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20%一30%鞘磷脂成分，它們可以被鞘磷脂酶水解而發(fā)生溶血，因此上述蛋白被命名為鞘磷脂酶類溶血素。將己知的鞘磷脂酶溶血素SP17627和預測的鞘磷脂酶溶血素結(jié)構(gòu)域種類、分布進行比較，結(jié)果見圖1一8。同時比較上述蛋白在結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸序列相似性，結(jié)果見表1一4。0100200300400500卜釗.一叫叫訓叫喇呻材州咐悶材一叫引引喇.一婦喇中一叫喇叫喇喇中P17627556aa鞘磷脂酶類濟血素各結(jié)構(gòu)域功能說明F19.1一呂Domaint’UnetionalanalysisofPutativesPh一ngomyelinase一likehemolysin圖1一8預測的鞘磷脂酶類溶血素蛋白結(jié)構(gòu)域分析表1一4鞘磷脂酶類溶血素與5P17627在各結(jié)構(gòu)域相似性比較(相同性，相似性，%)GenCIDP17627LA1027PD133144PD011673PD447657PD041204100，100100，10061，76100，10071，78100

使用PCR方法從鉤端螺旋體賴株染色體上擴增溶血素基因的相應片段，PCR引物、擴增體系以及擴增反應程度見實驗方法。溶血素擴增片段的大小以及重組表達的蛋白分子量、PI等信息見表1一5，PCR擴增結(jié)果見圖1一16。將擴增成功的基因片段進行DNA測序，確定它們與原基因組序列一致后，按照實驗方法操作，將其重組到質(zhì)粒pET28b(+)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLys中進行表達。表1一5No·oeneInpCRProduet(bP)體外克隆、表達溶血素重組蛋白的分子量a.a.net-PInet-M.W.his一Ihis一M.W.StabilityS

本文編號：2660914