【摘要】：NDRG（N-Myc downstream-regulated gene）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的基因家族，該基因家族由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4組成；此基因家族成員間有57-65%氨基酸同源性，經(jīng)生物信息學分析表明，NDRG2編碼的蛋白分子內(nèi)含有一個可以攜帶酰基的�；鶖y帶蛋白（ACP）結(jié)構(gòu)域和多種核轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，這是NDRG家族共同特有的結(jié)構(gòu)域。此特殊結(jié)構(gòu)或許決定了它們有著共同的表達及部分一致的功能，該基因家族參與了細胞的生長，但具體機制仍不清楚。 既往文獻報道NDRG家族在成年大鼠、小鼠及成人腦中都有不同程度表達；NDRG2在抑郁癥、阿爾海默氏病、應激及缺氧時，表達異常，說明NDRG2與腦部疾病具有高度相關性；目前NDRG1、NDRG2都被稱為腦分化相關基因；NDRG4在神經(jīng)前體細胞也有較高表達，受視黃酸（RA）等因子調(diào)控；NDRG3在腦發(fā)育中表達無明確報道。因此，推測其家族在腦組織中的廣泛表達可能與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關。目前研究已經(jīng)證實，此基因家族與腫瘤細胞的異常增殖、分化密切相關，NDRG2已被明確列為抑癌候選基因。 神經(jīng)前體細胞（NPC）的正常增殖、分化、遷移對于腦的發(fā)育至關重要，但其機制還不清楚。我們在前期驗證中發(fā)現(xiàn)，NDRG2在小鼠神經(jīng)前體細胞發(fā)生區(qū)高表達，提示其可能是調(diào)控NPC增殖、分化和遷移的重要基因。但NDRG2在人腦發(fā)育中是否有相同的表達特點，還尚不清楚；此外，NDRG家族的4成員具有高度氨基酸同源性且在進化中高度保守性，為了探索它們在腦發(fā)育中的作用，需首先明確其在腦內(nèi)的分布及細胞定位。 目的 通過研究NDRG2在在人胎腦及NDRG家族4個成員在小鼠生后各個腦區(qū)的表達特點及細胞定位，為探索NDRG家族在腦發(fā)育中的作用奠定基礎。 方法 應用免疫組化、免疫熒光、RT-PCR、Western Blot、細胞培養(yǎng)及電鏡等實驗技術，，研究NDRG基因家族在不同時間點人胎腦和小鼠生后各腦區(qū)的表達變化及細胞定位。（1）RT-PCR法檢測NDRG2mRNA在16-28周人胎腦不同腦區(qū)中的表達；（2）Western blot技術檢測NDRG2在28周各腦區(qū)的表達；（3）免疫組織化學法檢測NDRG2在人胎腦各腦區(qū)中的表達；（4）NDRG2與GFAP或NeuN的熒光雙標法研究其在胎腦中的細胞定位；（5）Western Blot、免疫熒光技術檢測NDRG家族4成員在出生后小鼠各腦區(qū)的表達及細胞定位；并在培養(yǎng)神經(jīng)前體細胞及其分化細胞中檢測NDRG2表達情況；（6）電鏡技術檢測NDRG2的亞細胞定位。 結(jié)果 （1）通過RT-PCR、Western Blot分別在RNA和蛋白水平檢測NDRG2在不同時間點的人胎腦腦區(qū)表達水平的變化。隨著胎齡成熟，NDRG2表達升高，尤其在腦室下帶、腦室管膜區(qū)域表達最為突出；（2）免疫組化從細胞水平進一步驗證了NDRG2主要在人胎腦腦室下帶、腦室管膜表達；免疫熒光雙標還明確了NDRG2可表達于星形膠質(zhì)細胞和相對成熟的神經(jīng)元中，主要定位于細胞質(zhì)中，極少數(shù)星型膠質(zhì)細胞細胞核也有表達；（3）用Western Blot明確了NDRG1-4成員在出生后小鼠不同時間點、不同腦區(qū)表達特征：21天鼠腦海馬區(qū)、腦室下帶等神經(jīng)發(fā)生區(qū)NDRG2有特異表達；在120天小鼠，表達明顯減弱；NDRG1、3、4在腦室下帶、海馬亦有表達，但無明確規(guī)律；（4）免疫熒光顯示NDRG1、3、4在出生后神經(jīng)前體細胞發(fā)生區(qū)無表達，NDRG2在小鼠腦海馬區(qū)以星形膠質(zhì)細胞胞漿特異性表達為主。NDRG2在培養(yǎng)分化的星形膠質(zhì)細胞胞漿表達；（5）在NDRG2在亞細胞定位研究中，發(fā)現(xiàn)NDRG2表達在神經(jīng)前體細胞及分化的星形膠質(zhì)細胞線粒體嵴和包膜上。 結(jié)論 （1）NDRG2在人胎腦腦功能區(qū)表達廣泛；隨著胎齡成熟，表達增強；在神經(jīng)前體細胞發(fā)生區(qū)最強，說明NDRG2與細胞增殖、分化及成熟密切相關。 （2）NDRG家族在出生后鼠腦區(qū)表達有明確區(qū)別，NDRG2主要表達于神經(jīng)發(fā)生區(qū)，NDRG1、3、4在神經(jīng)前體細胞發(fā)生區(qū)參與了分化，但與神經(jīng)前體細胞發(fā)生無特異性關系。 （3）NDRG2可能通過影響神經(jīng)前體細胞的線粒體功能調(diào)控其增殖、分化過程。
【圖文】：

弱 NDRG3 表達。另外 NDRG3 與 NDRG2 一樣在生殖系統(tǒng)的精子發(fā)育成揮著重要作用 [25,26,27,28]。NDRG4 基因位于染色體 16q21~q22.3,跨度 26 kb,包含 17 個外顯子,包括A 亞型序列(NDRG4-B、NDRG4-Bvar、NDRG4-H)。NDRG4 基因位于 16q2 39kb，由 19 個外顯子組成。選擇性啟動子作用于不同部位可產(chǎn)生三：NDRG4-A，NDRG4-B，NDRG4-C。每一個都含有一個缺少 18 號外 ， 因 此 NDRG4-A1, NDRG4-A2, NDRG4-B1, NDRG4-B2, NDRG4G4-C2 被分別表達。這六個變種可以解釋 NDRG4 蛋白在腦組織中的異 18 號外顯子的蛋白出現(xiàn)在胚胎和出生后腦組織中，而含有 18 號外顯子人的腦組織中表達[28]。在 NDRG4 三種亞型中；僅 NDRG4-B 在腦組織中G4-H 在大腦和心臟中均有表達，而 NDRG4-B（var）只是副產(chǎn)物。ND腦組織和心臟中表達比兒童豐富，且在阿爾茨海默氏病中表達明顯下降顯示 NDRG4 在腦神經(jīng)元和臍帶中表達[29]。（附圖 3）

這里的神經(jīng)前體細胞 (NPC)屬于具有自我增殖且具多種分化潛能的干細胞[32],增殖、分化后，跨過中間帶(IZ)，沿暫時存在的輻射狀膠質(zhì)細胞的纖維遷移到固定細胞層，并最終分化為具有各自功能的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞[102]附圖1、2。圖1 大腦皮層發(fā)育示意圖
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R338

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本文編號：2608856